ニュース

Jul 27, 2023

コンビ

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 13、記事番号: 4450 (2022) この記事を引用

9295 アクセス

5 引用

127 オルトメトリック

メトリクスの詳細

抗がん剤治療は多くの場合、短期間しか効果を示しません。 通常、腫瘍は薬剤耐性を獲得し、再発を引き起こしますが、薬剤の組み合わせで対処できる可能性があります。 適切な組み合わせを特定することは困難であり、患者の生検材料に対して直接、高含有量、高スループットの組み合わせスクリーニングを行うことで利益が得られると考えられます。 しかし、そのようなスクリーニングには大量の材料が必要であり、通常は患者から入手することができません。 これらの課題に対処するために、薬物効果の読み取り値としてトランスクリプトーム変化を使用して、ピコリットルサイズの液滴で何百もの薬物の組み合わせをスクリーニングする、Combi-Seq と呼ばれるスケーラブルなマイクロ流体ワークフローを紹介します。 私たちは、治療条件をコード化するための決定論的組み合わせ DNA バーコーディング アプローチを考案し、高度に多重化された方法での遺伝子発現に基づく薬剤効果の読み取りを可能にします。 当社では、Combi-Seq を適用して、条件あたり約 250 個の単一細胞液滴のみを使用して、K562 細胞のトランスクリプトームに対する 420 種類の薬物の組み合わせの効果をスクリーニングし、相乗的および拮抗的な薬物ペアとその経路活性を首尾よく予測します。

過去数十年にわたる大きな進歩にも関わらず、がんは依然として主要な死亡原因となっています。 がんの分子基盤についての分子的理解が深まったことで、標的療法の開発が可能になりました。 反応バイオマーカーを見つけるために患者をゲノム的に特徴づける多大な努力にもかかわらず、これらの治療法はこれまでのところ限られた有効性をもたらしており、患者の少数のサブセットにのみ提供されています1。

この状況を改善することが期待できるアプローチは、基礎条件での大規模ゲノムプロファイリングを、薬剤でがん細胞を撹乱した後の測定で補完することです2。 薬物スクリーニングの実施には多くのアプローチが使用できますが、多くの場合、スループットが低く 3、コストと時間が膨大で 4、大量の細胞が必要となる 5 ため、腫瘍生検ごとにスクリーニングできる潜在的な薬物の数が大幅に制限されます。 この制限は、薬物の組み合わせを検討する場合、潜在的な組み合わせの数が膨大であり、試験される薬物の数が増えるにつれて指数関数的に増加するため、さらに顕著になります。

スクリーニング能力が限られているため、薬物間相互作用をモデル化するためのコンピューターによるアプローチが開発されてきました6。 利用可能なデータリソースの増加により、薬効に関するモデルはここ数年で改善されましたが、薬の反応に関する予測は依然として困難であり、細胞株などの十分に特徴付けられた系に限定されているため、臨床への応用可能性は限られています。 さまざまなデータの種類の中でも、細胞の遺伝子発現状態は薬剤反応を高度に予測することが示されています 7。 さらに、LINCS8 などの薬物誘発性の転写変化のデータ リポジトリは、貴重なリソースであることが証明されています。 バルク 9,10 および単一細胞 11,12 トランスクリプトミクス用のプレートで利用可能な摂動スクリーニング プラットフォームはすでに存在しますが、通常、テスト条件ごとに多数の細胞が必要であり、薬剤の組み合わせのスクリーニングには使用されていません。 したがって、腫瘍生検をスクリーニングする可能性を備えた小型のコンビナトリアル薬物スクリーニングプラットフォームにトランスクリプトームの読み出しを統合することで、より適切な予測が可能になり、相乗的および拮抗的な薬物間相互作用の作用機序についての理解が深まるでしょう。

細胞スクリーニングを実行するための反応容器としてピコリットルからナノリットルサイズの液滴を使用する液滴ベースのマイクロ流体工学は、この目標を達成するための有望なアプローチを提供します。 従来のプレートベースのスクリーニングと比較して数桁以上の小型化により、少ない入力細胞数で作業しながら、薬剤または薬剤の組み合わせの数を大幅に増やすことができます13。 我々は以前、点字バルブを液滴マイクロ流体システムに統合して、チューブ内に連続的に保存されるいわゆるプラグ（約500 nlの大きな液滴）に薬剤の組み合わせを生成することによって、この方向の最初のステップを実証しました14。 プラグを使用して、膵臓腫瘍生検で 56 の組み合わせ治療オプションを直接スクリーニングし、表現型アポトーシスの読み取り値を使用して最も強力な薬物ペアを見つけました。 私たちの以前のアプローチは、患者材料を直接スクリーニングする最初の概念実証を提供しましたが、それでも 500 nl という比較的大容量のため、テストする薬物ペアの数が制限されました。 さらに、アポトーシスアッセイでは、薬物ペアの作用機序についての洞察が限られた単一のエンドポイント測定値しか提供されないため、耐性メカニズムに取り組むための薬物組み合わせの理解と予測可能性が大幅に向上する可能性があります。

これらの制限を克服するために、我々はここで、ピコリットルサイズの液滴のエマルション中で何百もの薬物の組み合わせの高度に多重化されたスクリーニングを実行できるマイクロ流体プラットフォームを紹介します。 2 つのバーコードのセットが薬物ペアをコード化する決定論的組み合わせバーコーディング アプローチを導入することで、空間的な順序 (ウェル、プラグ シーケンスなど) を維持する必要なく、高度に多重化された方法ですべての条件をスクリーニングすることができました。 DNA バーコードは薬物摂動後の細胞の全トランスクリプトーム解析用に設計されているため、さらに大規模並列化された遺伝子発現ベースの薬物組み合わせプロファイリングを実行することができました。 我々は、提示された Combi-Seq アプローチを細胞生存率および細胞シグナル伝達に対する薬物の影響を決定するために適用できることを実証し、相乗的な薬物ペアを発見し、それらの作用機序を解読するためのハイスループットなアプローチを提供します。

多重組み合わせ薬物スクリーニングは、薬物を DNA バーコードフラグメントと一緒にカプセル化することにより、単一細胞液滴中で実行されました（図 1a）。 各ペアの薬物の組み合わせは、2 つの DNA バーコード フラグメントの独自の組み合わせによってコードされており、これらが一緒になって逆転写 (ポリ dT) および PCR のためのプライミング サイトを提供します。 液滴のオフチップインキュベーション後、細胞溶解、バーコードフラグメントライゲーション、および逆転写用の試薬がピコインジェクションによって各液滴に追加されました15。 2 つのバーコード フラグメント (BC-RT および BC-PCR) をライゲーションすると、ペアごとの薬物の組み合わせをコードする機能的なバーコードが得られました (図 1)。 バーコードは溶解細胞から放出されたmRNAの逆転写に使用されたため、トランスクリプトームは薬物処理に従ってバーコード化されました（図1b）。 続いて、バーコード化されたcDNAが液滴から抽出され、シーケンスライブラリが構築されました（補足図1）。 最後に、シーケンスを実行して治療条件を多重分離し、遺伝子発現に対するその影響を分析しました。

Combi-Seq ワークフローの概要: (1) 細胞は、薬物の組み合わせと薬物をコードするバーコード フラグメントのペアでカプセル化されました。 （2）オフチップインキュベーション後、液滴をピコインジェクション用チップに再注入し、バーコードライゲーションおよび逆転写（RT）用の試薬を添加し、薬物治療に応じたトランスクリプトームのバーコーディングを可能にしました。 (3) 液滴破壊時に、同じ処理グループからの細胞が同じバーコードを共有する、配列決定用のプールされたライブラリーが生成されました。 これにより、薬物治療の逆多重化と 250 個の細胞のプールに対する遺伝子発現ベースの読み取りが容易になりました。 b 低入力細胞プールの薬物の組み合わせをエンコードおよびデコードするために適用されるバーコード化戦略。 バーコード付き PCR プライマー (BC-PCR) とバーコード付きポリ dT プライマー (BC-RT) のペアをライゲーション反応で結合して機能的なバーコードを形成し、これを逆転写に使用して 2 つの薬物の組み合わせをコードしました。 液滴を破壊することで、バーコード化された cDNA を回収し、配列決定のために増幅できます。 c 液滴内で薬剤の組み合わせを生成するために使用されるマイクロ流体パイプライン。 (1) 点字バルブを使用して、遅延チューブ内に 20 個の薬物バーコード (BC-RT) プラグのシーケンスを生成しました。 遅延チューブはドロップ メーカー (2) に接続され、そこにマルチウェル プレートからの細胞および薬剤 - BC-PCR 混合物が注入されました。 最後に、2 つのオイルバルブを開いてプラグをドロップメーカーに注入すると、バーコードと細胞を備えた薬物ペアを含む液滴が生成されました。 M1 ～ M3 は蛍光シグナルが取得された位置を示します。 d 遅延チューブ内の薬剤バーコードプラグの生成: (1) 対応するバルブを順番に開くことによって、油によって間隔をあけられたプラグが生成され、(2) 一連の 20 個の薬剤バーコードプラグが得られました。 (3) 2 つのオイル バルブを開くことによって、遅延チューブ内のプラグがドロップレット メーカー チップに注入されました。 e オートサンプラーによって注入された細胞懸濁液、薬剤-バーコードプラグ、および薬剤-バーコード混合物からの液滴生成。その結果、薬剤-バーコードの組み合わせによる細胞の共カプセル化が生じます。 f バルブモジュールからの 20 種類の薬剤と 96 ウェルプレートからの薬剤から薬剤の組み合わせを生成するスキーム。 20 個の薬物バーコード (BC-RT) プラグの各配列を、1 つのウェルからの薬物バーコード (BC-PCR) 混合物と組み合わせました。

ピコリットルサイズの液滴で薬剤の組み合わせを生成するために、点字バルブシステムとオートサンプラーベースの液滴メーカーチップへの薬剤注入を同期させました（図1c）。 さらに、細胞懸濁液を液滴体積あたり 0.1 細胞の密度で液滴メーカー チップに注入し、単一細胞を含む液滴を取得しました (補足ムービー 1)。 オートサンプラー (Dionex) には 96 ウェル プレートがロードされ、各ウェルには単一の薬剤と、対応するバーコード付きプライマー フラグメント (BC-PCR) および後の混合ステップのモニタリングを可能にするマーカー色素が含まれています。 薬物は連続的に吸引され、液滴メーカーに注入されました。 オートサンプラーからの 2 つのサンプル間の時間枠 (約 3 分) を使用して、化学的に異なる 20 個のプラグのシーケンスを生成しました。各プラグには、2 つの薬剤と 2 つのバーコード フラグメント (BC-RT および BC-PCR) の固有のペアが含まれています。二次医薬品とバーコード（BC-RT）を別の点字バルブチップに挿入します（図1cおよび補足図2a）。 特に、各複合バルブを順番に開き、間にフッ素オイルを注入して、非混和性の油相によって間隔をあけられた薬物バーコードプラグを遅延チューブに注入できるようにしました（図1d）。 遅延チューブが一連の20個のプラグで満たされたら、2つのオイルバルブを開いてすべてのプラグを液滴メーカーに注入しました（約2分、補足図2b）。

これにより、バルブシステムからの薬物バーコードプラグは、オートサンプラーから注入される薬物バーコード混合物と結合し、単一細胞と一緒に液滴にカプセル化されました（図1e）。 このプロセスを繰り返すことにより、バーコード断片の特定のペアとの数百の組み合わせが生成されました (図 1f)。 オートサンプラーから注入される薬剤の数を増やすことで、組み合わせの数をスケールアップできることに注意することが重要です。

オートサンプラーとバルブベースの薬物注入間の同期は、オートサンプラーから注入された薬物がプラトー濃度に達した場合にのみ組み合わせが生成されるようにするために非常に重要でした。 蛍光色素の交互注入によって示されるように、オートサンプラーからの各薬物の間に、濃度の減少と増加の時間枠が観察されました（図2a）。 この現象は、オートサンプラーの連続混和キャリア相 (PBS) における溶質の Taylor-Aris 分散に基づいています 16。その時間枠内では組み合わせは生成されず、むしろ点字モジュールの遅延チューブ内で複合プラグを生成するために使用されました。 。 蛍光マーカー色素の一定強度の測定によって示されるプラトー濃度に達したら、20 個の化合物プラグを液滴メーカーに注入し、オートサンプラーからの薬剤および細胞と液滴に混合しました。 このようなプラグ列の 1 つの注入には 2 分かかり、細胞と 1 つのバーコード付き組み合わせ治療条件を含む約 2500 個の液滴を生成するための全体時間 (プラグの生成と注入) ​​は 15 秒でした。 20 個すべてのプラグが注入されると、オートサンプラーは次の薬剤の吸引を開始しました。

a オートサンプラーを使用して、96 ウェル プレートから Alexa-488 または Cascade-Blue を交互に注入します。 蛍光シグナルの減少および増加の時間枠内に注入​​されたサンプル (灰色のボックス) は、組み合わせが生成されないことを確認して廃棄されました。 点字ディスプレイからの薬物バーコード プラグは、濃度が不安定な時間枠 (灰色のボックス) では注入されなかったため、液滴には機能しないバーコードのみが含まれていました (BC-PCR)。 安定した蛍光シグナルを伴う時間窓 (青いボックス) を使用して、点字ディスプレイ チップ上で生成された 20 個のプラグを同時注入することによって薬剤の組み合わせを生成し、機能的なバーコードを生成しました。 b 位置 M1 (=組み合わせ混合前) で測定された、Alexa-488 または Cascade-Blue のいずれかを補充した点字弁からのプラグシーケンスの蛍光強度。 (a) と (b) を接続する青色のオーバーレイは、20 個のプラグ (参照色素を含まない 2 番目のプラグ) の 1 サイクルがオートサンプラーからの 1 つのサンプルと組み合わされる時系列を示しています。 Cascade-Blue または Alexa-488 を補充した薬剤の交互配列を使用して、両方の注入モードで個別に、特定の (緑色など) 蛍光陽性プラグとその後の陰性 (青色など) サンプル間の相互汚染を定量しました。 c 点字ディスプレイからの緑色のプラスのプラグから緑色のマイナスのプラグへの相互汚染 (b に示すように 11 サイクル)。 d 3 つの異なるチップのプラグの相互汚染: 青色または緑色の陰性プラグと、前の青色または緑色の陽性プラグの蛍光強度の比を分析して、連続サンプル間の相互汚染のレベルを定量化しました (n = 99、n =それぞれ80、n = 171）。 e 組み合わせ混合物を含む液滴の蛍光シグナル。 Cascade-Blue 標識プラグのみから生成された液滴およびオートサンプラーから注入された Alexa-488 のみから生成された液滴について測定された蛍光強度を表す散布図 (n = 91,899)。 f (e) からの液滴の蛍光シグナルは、180 個の個別の組み合わせについて示されています。 色は、オートサンプラーからの 1 つの薬剤と組み合わせた 20 の薬剤プラグのサイクルを表します。 箱ひげ図は、中央値、第 1 四分位数、および第 3 四分位数をボックスとして表示し、ひげはボックスの長さ 1.5 以内の最も極端なデータ ポイントを示します。 M1～M3は図1cに示す位置を示します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

相互汚染を最小限に抑えて液滴内容物を確保するために、薬物とバーコードの混合物がチャネル内に残らないように、点字バルブドロップメーカーチップの形状と遅延チューブコネクタを設計しました（補足図3）。 各実験の前に、点字ディスプレイのプラグ間の汚染レベルの代用値を測定しました。 これは、Alexa-488またはCascade-Blueを交互に添加した薬剤を使用することによって行われ、その結果、青と緑の蛍光ピークの交互配列が得られました（図2b）。 プラグの蛍光強度がドロップレットメーカーで測定され、あるプラグから次のプラグへの薬物/染料の汚染が、UVピークの緑色シグナルまたは緑色ピークのUVシグナルのいずれかによって検出されました（図2c）。

緑色またはUVチャネルの各負のピーク（n）からの蛍光シグナルと前の正のピーク（n-1）との比を代用として使用し、2つの薬剤間の相互汚染のレベルを定量化しました（図2d） ）。 3 つの異なるチップ設定 (点字バルブとドロップメーカー) にわたって、UV チャネルでの汚染の平均が 1.5%、緑色チャネルでの汚染の平均 0.7% であることがわかりました (補足表 1)。これは、説明したシステムを適用して生成できることを示しています。十分に高い純度の組み合わせ。

記載されたマイクロ流体パイプラインでは、オートサンプラーと点字バルブ モジュールから注入された薬剤を混合することによって薬剤の組み合わせが生成されました。 液滴内の正確な薬物濃度を確保するには、両方の薬物を一定の事前定義された比率でカプセル化する必要がありました。 点字ディスプレイ上のすべての化合物を Cascade-Blue で補完し、オートサンプラーのすべての化合物を Alexa-488 で補完することにより、2 つの薬物の正確な混合を検証しました。 青と緑の二重陽性液滴の非常に高密度の主集団の1つを観察し、両方の化合物が一定の比率で共カプセル化されていることを実証しました（図2e）。 さらに、個々の組み合わせにわたって液滴に対する2つの色素の安定した共カプセル化が確認されました（図2f）。 個々の組み合わせの蛍光強度の中央値は非常に安定しており、180 個の組み合わせにわたる変動係数 (CV) は青と緑の強度でそれぞれ 2.9 % と 3% でした。 主要集団の周りの液滴の散乱は、プラグの最初と最後における短い（100ミリ秒未満）流れの平衡段階と、集束レーザービーム内の液滴軌道の変動によって説明できます（補足図4および補足ムービー2）。 。 その結果、注入モード (点字バルブまたはオートサンプラー) を確実に同期させて、高精度かつ純度で液滴内に薬剤の組み合わせを生成できると結論付けました。

マイクロ流体パイプラインの特性を評価し、遺伝子発現に基づく組み合わせ薬物スクリーニングの実行への適用性を実証するために、小規模な 4 × 4 薬物スクリーニングを設計しました (表 1)。 まず、点字バルブとオートサンプラーからの薬剤の注入モードが偏りを引き起こすかどうかを評価したいと考え、点字バルブとオートサンプラーに同じセットの薬剤をロードしました。 注射バイアスの場合、同じ組み合わせの間で逆の順序で差異が生じることが予想されます（例、イマチニブとトラメチニブ対トラメチニブとイマチニブ）。 第二に、遺伝子発現の読み取りに対するバーコーディング モードの影響を評価することを目的としました。 この目的のために、まず点字弁から注入される薬剤にはバーコード付き BC-RT が補充され、オートサンプラーからの薬剤には BC-PCR が補充されるという治療条件をコード化しました。 次に、オートサンプラーからの BC-RT コード化薬剤と点字弁からの BC-PCR コード化薬剤を使用して実験を繰り返し、バーコード モードが読み取り値に影響を与えなければ同等の結果が得られることを期待しました。 説明したパイプラインを使用して、それぞれ単一のヒト白血病 K562 細胞と、薬物と対応するバーコードのすべてのペアの組み合わせを含む液滴を生成し、エマルションを 12 時間インキュベートしました。 ライゲーション後、2 つのバーコード化されたプライマー フラグメントは、ペアの薬物の組み合わせをコードする 1 つの機能的なバーコードを形成しました。 3 つの複製を取得するために、プロセス全体が 3 回実行されました。

連結された各バーコードを使用して、混乱した細胞からトランスクリプトームを逆転写しました（図1a）。 データの前処理（方法遺伝子発現データの前処理）と初期品質管理（サンプルあたりの中央値読み取りと遺伝子数はそれぞれ3.47×105と3229、補足図5）の後、t分布の確率的近傍埋め込み（t -SNE、図 3a) は逆多重化されたカウント行列に基づいています。 注入源 (オートサンプラーまたは点字バルブ) に基づいて何らかの体系的な偏りが生じるかどうかを分析するために、オートサンプラーの薬物 (図 3a、左上のパネル)、点字バルブの薬物 (図 3a、右上のパネル) に従ってサンプルを分析しました。 、「順序付けられた」薬剤の組み合わせ（例えば、イマチニブ-トラメチニブとトラメチニブ-イマチニブの組み合わせを区別した場合）、および「順序付けされていない」薬剤の組み合わせ（イマチニブ-トラメチニブサンプルとトラメチニブ-イマチニブサンプルが区別されなかった場合）。 オートサンプラー (図 3a、左上のパネル) または点字バルブ (図 3a、右上のパネル) からの単一薬剤の注入モードは、個々のデータ ポイントのクラスタリングに中程度の影響しか与えませんが、それらのペアごとの組み合わせ (図 3a) .3a、下のパネル) は、サンプル間の凝集と分離に対するより強力な決定要因です。

a 正規化された遺伝子発現データの TSNE プロット。 サンプルは、オートサンプラーの薬剤 (左上のパネル)、点字バルブの薬剤 (右上のパネル)、順序付けされた組み合わせ (左下のパネル)、および順序付けされていない組み合わせ (右下のパネル) に基づいて色分けされています。 オートサンプラーと点字バルブの薬剤（上部パネル）にはカラーコードが表示されています。 b オートサンプラー/点字バルブ薬剤および順序付き/順序なしの組み合わせに基づくサンプル クラスタリングのシルエット スコア。 シルエット スコアは、サンプル ラベルを並べ替えることによって作成されたランダムな分布 (カラー コード) と比較されます。 c サンプルのパスウェイ活性ヒートマップ。 PROGENy 経路活性はサンプルごとに計算され (経路活性の Z スコア、カラーコード)、経路活性マトリックスが階層的にクラスター化されました。 組み合わせた薬剤は色分けされています (薄緑色: オートサンプラーの薬剤、青: 点字バルブの薬剤、シアン: オートサンプラーと点字バルブからの同じ薬剤)。 d 薬物誘発性の経路活性の変化。 線形モデル (pathway_activity ~YM155 + イマチニブ + トラメチニブ) が各経路に適合され、各薬物の線形モデル係数 (カラー コード) がヒートマップとしてプロットされます。 e 薬物誘発性の MAPK 活性の変化。 MAPK 活性 (y 軸) はオートサンプラーの薬剤 (x 軸) および点字弁の薬剤 (カラーコード) に基づいてグループ化され、YM155_Imatinib および DMSO_Imatinib n = 2 を除くすべてのサンプルに対する生物学的独立実験 n = 3。箱ひげ図は中央値を示します。および第 1 四分位数と第 3 四分位数がボックスとして表示され、ひげはボックスの長さ 1.5 以内の最も極端なデータ ポイントを示します。 f 交換されたバーコード割り当て (r = 0.637、p = 0.01、および R2 = 0.406) を使用して実行された、2 つの 4 × 4 画面間の MAPK 経路活性の相関。影付きの領域は、回帰推定値の 95% 信頼区間を示します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

順序付けされた組み合わせと順序付けされていない組み合わせの注入源に基づいてサンプルのクラスタリングの範囲をさらに定量化するために、シルエット分析を実行しました（図3b、およびメソッドクラスタリングベースの遺伝子発現データの品質管理）。 シルエット スコアの分布はクラスターの数 (薬物の場合は 4、順序なしの場合は 16、順序のある組み合わせの場合は 10) に依存するため、クラスタリングのシルエット スコアを、サンプル ラベルを並べ替えることによって作成されたランダムな分布と比較しました。 単一の薬物および組み合わせのシルエット スコアは、バックグラウンド分布よりも有意に高く (p 値 <0.01)、使用された薬物および組み合わせに基づいてサンプルがクラスター化されていることを示しています。 したがって、点字弁から注入される単一薬剤のバーコードモードや、バーコード化された RT プライマーまたは PCR プライマーでコード化されたオートサンプラーもバイアスを導入しません。これは、クラスタリング、ひいては遺伝子発現に対する影響が区別できないためです。 これとは対照的に、ペアごとの組み合わせはサンプルのクラスタリングによって促進され、両方の薬物が公平な方法で一緒に検出されたことが示されました。 また、サンプル全体で最も発現量の高い 100 個の遺伝子を使用して階層的クラスタリングを実行しました。これにより、薬物および組み合わせに基づくサンプルのクラスタリングも示されました（補足図 6）。 さらに、処理されたサンプルは一般に、主成分分析（PCA、補足図7）においてDMSO対照から十分に分離されました。 私たちの実験パイプラインが重大な技術的バイアスを導入していないことをさらに実証するために、バーコードを交換した小さな 4 × 4 スクリーンを実行しました (点字バルブの薬剤には BC-PCR を補充し、オートサンプラーの薬剤には BC-RT を補充しました)。 同様の品質（補足図8）と、tSNEおよび上位100の発現遺伝子に基づくサンプルのクラスタリング（補足図9a、b、10）が観察されました。

さまざまな組み合わせで処理した細胞の遺伝子発現サインをさらに分析するために、PROGENy 法を使用して各サンプルの経路活性の変化を計算しました 17、18、19。 PROGENy は、14 のがん関連経路の遺伝子発現データから経路活性を計算します。 パスウェイ活性に基づくサンプルの階層的クラスタリング (図 3c) も、薬物および組み合わせに基づくクラスタリングを示しました。 2 つの主要なクラスターが観察され、1 つは YM155 を含む組み合わせに対応し、もう 1 つはトラメチニブ処理サンプルが大半を占めていました。 経路活性の変化と薬物との関連性を分析したところ（図3d）、すべてのYM155処理サンプルで低酸素経路の活性が低下していることがわかりましたが、すべてのトラメチニブ（MAPK阻害剤）処理サンプルではMAPKの強力な不活化が示されました（図3e、p）線形モデルからの値: 0.03)、および関連する EGFR 経路。 さらに、小さな4×4画面（図3e）と交換された4×4画面（補足図9e）からのMAPK経路活性スコアを相関させると、有意な相関関係が見つかりました（r = 0.637、p = 0.01）。経路活性の再現可能な検出を示しています（図3f）。 経路分析は、観察された遺伝子発現の変化が、使用された薬剤の既知の作用機序に対応していることを示唆しており、これについては以下の議論で詳しく説明します。 要約すると、この結果は、組み合わせによって誘導される遺伝子発現変化をハイスループットで分析するための我々のスクリーニング法の使用を裏付けており、これまでに使用されていた表現型アッセイと比較して、より詳細に薬物反応の特徴付けが可能になる14。

Combi-Seq パイプラインの堅牢性を評価するために、液滴での 4 × 4 Combi-Seq 薬物スクリーニングのパスウェイ活性と、マルチウェル プレートで実行された同じスクリーニングの活性 (読み取り数中央値 1.07 × 106) を比較しました。 バルク（補足図11）データと液滴（図3c）データからの経路活性間の相関関係の階層的クラスタリングにより、経路活性の正の相関によって駆動される2つの主要なクラスターが得られました。両方の形式で、1つのクラスターがYM155処理間の正の相関によって形成されました。細胞と他のクラスターはイマチニブ治療の正の相関によって駆動されました（図4a）。 したがって、浅いシーケンスを読み出しとして使用する低入力の液滴ベースの薬物スクリーニングが、パスウェイ活性の機能レベルでバルクの高入力のディープシーケンスデータの主な特徴を捕捉することを実証できました。 さらに、Combi-Seq バーコーディング戦略と、バルク形式での従来のポリ A ベースの mRNA キャプチャ (PolyA) を比較しました。 Combi-Seq データと PolyA データの間の遺伝子発現は、0.576 と 0.646 の間の相関係数を示しました (補足図 12)。これは、さまざまな RNA-Seq シーケンシングアプローチの以前の比較の結果に匹敵します (例: Prime-Seq 対 True-Seq: R2 =これは、Combi-Seq アプローチがライブラリー調製ステップ中に大きなバイアスを導入しないことを示唆しています。

バルクと液滴の Combi-Seq データの経路活性間の相関関係のヒートマップ: 各サンプルの PROGENy 経路活性を決定し、マイクロタイター プレート (行) または液滴 (列) で得られたデータを使用して一致するサンプルの相関を計算しました (カラー コードは青)から赤まで)、階層的クラスタリングを実行するために使用されます。 組み合わせた薬剤は色分けされています（薄緑：オートサンプラーの薬剤、青：点字バルブの薬剤、シアン：オートサンプラーと点字バルブからの同じ薬剤）。 b ERCC 投入濃度と、サンプルあたり 250 細胞の測定された 100 万あたりの転写産物 (TPM) との相関としてのスパイクイン検出の精度。影付きの領域は回帰推定値の 95% 信頼区間を示します。 (c) サンプルあたり 125 細胞 (R = 0.63 および R2 = 0.40)、250 細胞 (R = 0.65 および R2 = 0.42)、および 500 細胞 (R = 0.7 および R2 = 0.49) の相関係数の概要、n = 5 の生物学的独立実験、データは平均値 ± 95% 信頼区間として表示されます。 d サンプルあたり 250 個の細胞に対するスパイクイン分子の検出確率としての感度。 スパイクインは、確率が 50% に達したときに検出されたと見なされます。 e サンプルあたりのさまざまな量（125、250、および500）の細胞に対する感度の概要、n = 5の生物学的独立実験、データは平均値±95％信頼区間として表示されました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

Combi-Seq アプローチの感度と精度をテストするために、外部 RNA コントロール コンソーシアム (ERCC) からの 92 の異なる DNA 配列のライブラリーをさらに利用しました。 ERCC分子を液滴にスパイクインし、精度（図4b、ERCC分子濃度と測定された発現の相関関係）と感度（図4d、ERCC分子検出の閾値）を分析しました。 精度（125、250、および500の入力セルに対するピアソン相関がそれぞれ図4c、0.63、0.65、0.7）と感度（図4e、2.55、2.06、および1.48 log10（アトモル/μl）検出限界）の増加が観察されました。投入材料（液滴あたりの細胞数、追加される ERCC スパイクインの量は細胞数に比例して増加します）を増加させた Combi-Seq メソッドのそれぞれ 125、250、および 500 投入細胞の場合）。 これらの結果は、他の低入力 RNA-Seq アプローチの範囲内です 21。

4 × 4 薬物併用実験の有望な結果に基づいて、合計 420 の異なる併用治療条件を使用してハイスループット スクリーニングを実行しました。 この研究では、logD 値が低い薬物を意図的に選択しました (補足図 13 および補足データ)。 このようにして、典型的には疎水性の化合物の望ましくない交換を最小限に抑えることができます22。 さらに、薬物交換が測定値に影響を与えるかどうかをテストするために、一連の体系的な実験を実行しました。 特に、1つの薬物と細胞のみを含む液滴（処理済み）と、DMSOと細胞のみを含む液滴（DMSOコントロール）を混合し、37°C​​で24時間インキュベートしました（補足図14a）。 さらに、DMSO を含む液滴と細胞をインキュベートし、未処理の表現型の陽性対照として個別に処理しました (個別の DMSO 対照)。 続いて、細胞を溶解し、バーコードをライゲーションして、全トランスクリプトーム配列決定のための逆転写を実行しました（補足図14b）。 UMAPを使用したデータの投影では、処理サンプルとDMSO対照サンプルが分離され、DMSO対照サンプルの大部分が一緒にクラスター化されました（補足図14c）。 これは、24 時間のインキュベーション期間にわたって、薬物の効果は最初から薬物を含む液滴についてのみ観察され、DMSO のみを含む液滴については観察されないことを示しています。 説得力のあることに、薬物を含む液滴とともにインキュベートされた未処理の DMSO サンプルは、イマチニブなどの LogD 値が正の薬物であっても、個別に処理された DMSO 対照とよくクラスター化しました。 大規模な組み合わせスクリーニングに最適な薬物濃度を推定するために、K562 細胞を使用して用量反応曲線を作成し、各単一薬物の 35% 増殖阻害値 (GR) を決定しました。 従来の指標である IC50 値と比較して、GR50 (またはこの場合は GR35) は薬物治療中に発生する分裂数の影響を受けにくく、細胞株や条件によって異なる可能性があります (補足データ)。 23. 薬物は点字バルブまたはオートサンプラーに割り当てられ、高い GR35 値と低い GR35 値を持つ薬物のバランスのとれた分布が実現されました。 点字バルブまたはオートサンプラーにロードされた薬剤には、それぞれ BC-RT または BC-PCR が追加されました。 420の処理条件ごとに単一細胞を含む250個の液滴を生成することを目的とし、細胞溶解、バーコードライゲーション、およびRTのためのピコインジェクションを実行する前に、液滴を37°Cで12時間インキュベートしました（図1a）。 このプロセスを 3 回実行して複製を取得しました。

最初の前処理と品質管理（サンプルあたりのリードと遺伝子の中央値はそれぞれ32892と547、補足図15）の後、4についてと同じ次元削減（図5a）とシルエット分析（図5b）を実行しました。 ×4画面。 ここでも、サンプルは、使用された組み合わせに基づいて、ランダムに予想されたものよりも有意に良好にクラスター化されました（シルエットスコア対ランダム分布のp値：オートサンプラー薬、点字弁薬、および組み合わせについて、それぞれ<0.01、0.47、および<0.01）。 また、細胞数が少ないことは、遺伝子発現に基づいて処理細胞と未処理細胞を区別する能力に影響を及ぼさないこともわかりました（補足図16a）。

a 正規化された遺伝子発現データの TSNE プロット。 YM155 (左パネル)、ブレビスタチン (中央パネル)、および YM155 とブレビスタチンの組み合わせで処理したサンプルを代表例として表示します。 b オートサンプラー/点字バルブの薬剤と組み合わせに基づくサンプル クラスタリングのシルエット スコア。 シルエット スコアは、サンプル ラベルを並べ替えることによって作成されたランダムな分布 (カラー コード) と比較されます。 (c) LINCS-L1000 データとの薬物シグネチャ類似性の ROC 分析。 各薬剤について、コンセンサス シグネチャが計算され、対応する LINCS-L1000 シグネチャとの類似性 (スピアマンの順位相関) が計算されました。 類似性値は ROC 分析の予測値として使用され、真陽性はハイスループット スクリーニングと LINCS-L1000 の間で一致した薬物ペアでした。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

ハイスループットスクリーニングの遺伝子発現値が生物学的に意味があるかどうかをさらに調査するために、得られた遺伝子発現シグネチャを、公開されている LINCS-L1000 データセット内の同じ薬剤で利用可能なシグネチャと比較しました8。 LINCS-L1000 には単剤療法薬物治療の発現シグネチャのみが含まれるため、ハイスループット スクリーニング (遺伝子発現シグネチャの機能的ゲノム分析) の各薬剤のコンセンサス シグネチャを計算し、これらを LINCS-L1000 データベースから生成されたコンセンサス シグネチャと比較しました。利用可能なすべての細胞株と濃度用量 (LINCS-L1000 には K562 細胞から直接得られたデータが含まれていないことに注意してください)。 当社のマイクロ流体スクリーニングで使用された 32 種類の薬剤について、LINCS-L1000 上の対応するデータが利用可能でした。 これらの特徴の類似性を比較するために、2 つのデータセットにわたるすべての薬物ペアのスピアマン相関係数を計算しました。 ROC 分析では、2 つのスクリーニングからの同じ薬剤のシグネチャ (真陽性) が、無関係な薬剤ペアのシグネチャよりも類似していることが示され (図 5c、ROC AUC: 0.59)、ROC 曲線の下のこの領域は比較して統計的に有意です。薬物ラベルを並べ替えることによって作成されたランダムな分布に変化します（補足図17、p = 0.019）。

まとめると、ハイスループットのコンビナトリアル薬剤スクリーニングでは、注入 (点字バルブまたはオートサンプラー) とバーコーディング モードがデータに偏りがなく、データと LINCS-L1000 の間の薬剤シグネチャの相関が顕著な類似性を示したことを実証しました。 その結果、我々は、Combi-Seq アプローチを適用して、低投入材料と読み出しとして浅い RNA-seq を使用して大規模なコンビナトリアル薬物スクリーニングを実行できると結論付けました。

使用した薬剤濃度はすべて GR35 値であったため、相乗的な組み合わせでは細胞生存率の低下につながる可能性があり、拮抗的な組み合わせでは細胞生存率の増加が期待されました。 細胞生存率を直接測定しませんでしたが、CEVIChE アルゴリズム（遺伝子発現シグネチャのメソッド機能ゲノム分析）18 を使用すると、遺伝子発現データから使用されたすべての薬剤の組み合わせに対する細胞生存率の変化を推測することができました（補足図 18）。細胞数は低く、検出されたミトコンドリア遺伝子のパーセンテージとは無関係でした（補足図16b、19）。 薬剤の組み合わせと単剤治療の間で予測される生存率の低下を比較することにより、420 ​​の組み合わせすべての相乗効果スコアを決定しました (図 6a)。 我々は、潜在的な相乗作用と拮抗作用の組み合わせのクラスターをいくつか発見しました（例：それぞれトリシリビン-ダカルバジン、ラゾキサン-トラメチニブ）。 ハイスループット薬物スクリーニングの相乗効果に関する予測を実験的に検証するために、トリシリビン、YM155、ラゾキサン、ドキソルビシンとダカルバジン、イマチニブ、トラメチニブのすべての可能な組み合わせを用いて、マイクロタイターで5×5用量マトリックスコンビナトリアル細胞生存率スクリーニングを実行しました。プレート形式。

420 種類すべての薬剤の組み合わせと対応する単剤治療の生存率を比較することによって決定された予測相乗効果スコアを示すヒートマップ。 b 実験細胞生存率と予測細胞生存率の間の相関関係 (ピアソン相関 r = 0.66、p = 0.018、R2 = 0.44)。 薬物相乗効果 (y 軸) はマイクロタイター プレート形式 (カラー コード) で 12 の組み合わせについて測定され、予測された相乗効果値 (x 軸) に対してプロットされました。影付きの領域は回帰推定値の 95% 信頼区間を示します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

我々は、Bliss 独立相乗効果モデル (マイクロ流体スクリーンからのヒットを検証するためのプレートベースの生存率測定方法) を使用して、テストした 12 の組み合わせの相乗効果スコア (正: 相乗的、負: 拮抗的) を計算しました 24。 12の検証された組み合わせの中で、拮抗作用がより一般的であり、これは以前に公開されたデータに匹敵します（補足図20）。 12の測定（プレート実験）および予測（マイクロ流体システムで得られた遺伝子発現データから）の相乗効果は、有意な相関関係を示しました（図6b、ピアソン相関 r = 0.66、p = 0.018、ラゾキサン-トラメチニブを使用しない場合の値については補足表2を参照） ）。 この比較により、トラメチニブとトポイソメラーゼ 2 阻害剤の組み合わせが拮抗作用を示す一方、BCR-ABL 阻害 (イマチニブ) は YM155 でサバイビンを阻害することでアポトーシスの誘導を増加させ相乗効果を発揮することが確認され、当社の Combi-Seq プラットフォームの発見可能性がさらに確認されました。

要約すると、当社のコンビナトリアルマイクロ流体遺伝子発現プラットフォームを使用して、(i) 測定された遺伝子発現値が化学的摂動に基づいてクラスター化されること、(ii) 得られたデータが公的単剤療法摂動プロファイルとよく一致すること、および (iii)予測された細胞生存率と薬剤の相乗効果は、選択されたヒットについてマルチウェル プレート形式で検証できます。 まとめると、これは、薬物治療あたりわずか約 250 個の細胞を配列決定する高度に多重化されたマイクロ流体フォーマットで得られた遺伝子発現プロファイルから包括的な情報がどのように得られるかを示しています。 これにより、ワークフローは、患者サンプルなどの非常に限られた材料を使用する場合に特に興味深いものになります。

化学療法や分子標的薬による治療を個別化するためのがん患者の層別化は、がん治療の成功率を高めることが示されています 25、26、27。 これらの取り組みは主に、薬剤感受性を説明する形質を特定するために、腫瘍または細胞株のゲノムおよび転写の状況を分析することによって推進されています 28,29。 同定されたさまざまなゲノム マーカーやトランスクリプトーム マーカーが臨床でうまく使用されていますが、それらは腫瘍の種類や患者のごく一部にしか利用できません 1。 さらに、多くの患者はしばしば腫瘍再発 30 に悩まされていますが、その主な原因は腫瘍内の不均一性 31 です。 再発は、多くの場合、薬剤に対する耐性メカニズムの急増によって引き起こされ、単一薬剤の効果が短命になります32。 薬剤の組み合わせによる治療は薬剤耐性のリスクを軽減する可能性をもたらしますが、その予測と経験的評価は依然として困難です。

これらの課題の解決を進めるために、グローバルトランスクリプトミクスを読み出しとして使用して、単一細胞液滴における高度に多重化されたコンビナトリアル薬物スクリーニングを可能にするマイクロ流体パイプラインをここで紹介します。 治療条件の決定論的なバーコーディングを統合することにより、遺伝子発現の変化によって薬剤の組み合わせの有効性を評価することができ、トランスクリプトームシーケンス全体から包括的な読み取り値を得ることができました。 当社のパイプラインを適用して、単一チューブ内で 420 の組み合わせ治療条件をスクリーニングし、高レベルの多重化を示しました。 液滴形式でのアッセイの小型化に基づいて、試験条件ごとに必要な細胞はわずか約 250 個であったため、患者の材料を直接個別にスクリーニングする道が開かれ、患者由来の細胞株またはオルガノイドで組み合わせスクリーニングを実行できる規模が大幅に増加しました。そして回転楕円体。

当社は、マイクロ流体プラットフォームをモジュラー システムとして設計しました。このシステムでは、点字表示バルブにより、遅いオートサンプラーベースの注入の制限を克服して、注入する薬剤を迅速に切り替えることができます。 両方が液滴生成器上で組み合わされるため、薬剤の組み合わせを迅速かつ効率的に生成することが可能になり、単一細胞を化学的多様性の高い液滴にカプセル化することが可能になります。 ここで使用されるオートサンプラーは、最大 3 つの 96 ウェル プレートまたは 384 ウェル プレートから薬剤を注入するため、薬剤の組み合わせの数は、1 回の実験で理論上の最大値 3 × 384 × 20 = 23,040 の組み合わせまでさらにスケールアップできます。 その規模で最も制限となるのは、機器のスループットではなく、配列決定のコストと利用可能な材料（たとえば、一次細胞を使用する場合）です。

このような多数の薬剤の組み合わせを単一細胞レベルでスクリーニングできる可能性により、大きな可能性が追加されることがわかります。ピコインジェクション (細胞溶解) ステップの上流に蛍光ベースの液滴ソーティングを組み込むことで、たとえば、物理的な分離と配列決定に使用できる可能性があります。 1 回の実験で 420 の治療オプションすべてに対する耐性クローンを作成（例：以前に使用した表現型カスパーゼ 3 アッセイの実施）14。 このようにして、応答細胞と比較したトランスクリプトーム特徴の違いを分析することができ、耐性の新しいバイオマーカーとこれらを克服するための（化学）感作物質を明らかにするための高度に多重化された研究への道が開かれます。 最近実証されたように、薬物摂動の単一細胞の読み取りは、不均一な薬物応答についての優れた洞察を提供します 11。 患者の生検に対してこのようなスクリーニングを行うことで、腫瘍の不均一性が薬物反応に及ぼす影響を分析し、それによってより効果的な薬物の組み合わせを定義し、さらにそれらの潜在的な耐性メカニズムについての洞察を得ることが可能になります。 原発腫瘍細胞（または顕微鏡的断片）のカプセル化および/またはそれらのスフェロイドへの拡大を可能にするために、我々は、以前に示したように、液滴内での細胞接着および増殖のための支持構造を統合することを目指しています33、34。

生成されたすべてのデータセットは、バーコード アプローチも注入モードも遺伝子発現ベースの読み取りに偏りがないことを示しています。 インジェクションモードとバーコーディングモードの両方による単独療法は同様の影響を及ぼしましたが、それらの組み合わせは遺伝子発現に最も強い影響を及ぼし、観察されたクラスター化の主な要因でした。 これは、提示されたマイクロ流体ワークフローの非常に正確で正確な動作と、決定論的バーコーディングアプローチの特異性を裏付けています。 さらに、大規模スクリーニングからの単剤療法のコンセンサス遺伝子発現シグネチャと、LINCS-L1000 データセットからの薬剤シグネチャとの間に顕著な類似性が見つかり、高い再現性が示されました。 パスウェイ活性分析では、階層的クラスタリングが主に 3 つの薬剤 YM155、イマチニブ、トラメチニブによって推進されていることを発見しました。これは薬剤特異的効果の検出をさらに裏付けます。 2つの主要なクラスターは、MAPKおよびEGFR経路活性を阻害するトラメチニブ治療と、低酸素症およびTRAIL関連経路を阻害しながらMAPKおよびEGFR経路活性の上方制御を誘導するYM155治療の相反する効果によって引き起こされました。 MAPK に対するトラメチニブの効果は予想されています 35 が、YM155 によるサバイビン阻害の効果は、複雑なシグナル伝達とサバイニンに関する知識が不完全であるため、あまりよく理解されていません 36。 サバイビンの発現は、MAPK 経路を介した Sp1 および c-Myc の活性化によって調節されることが記載されているため 37、薬物標的の濃度が高くなると薬物効果が低下するため、MAPK 経路活性の増加は、反作用メカニズムを反映している可能性があります。 サバイニンの発現は白血病における薬剤耐性と関連しているため、YM155とトラメチニブの併用治療は、サバイビンの阻害とMAPK経路によって誘導される推定の代償発現により、再発の可能性を減らす有益な効果をもたらす可能性があります。 まとめると、これらの発見は、記載されたマイクロ流体パイプラインが経路活性に対する薬物の組み合わせの影響を解きほぐすために適用できることを示している。 このような情報は、潜在的な耐性メカニズムを特定し、効果的な薬剤の組み合わせを予測するために患者の生検をスクリーニングする際に大きな影響を与えます。 これらのサンプルはより深い深さで配列決定されているため、摂動時の経路活性の分析は検出された遺伝子の数によって制限され、したがって小さな 4 × 4 スクリーンに制限されました。 420 種類の薬物の組み合わせすべてについて同程度の数の遺伝子を検出するには、10 倍の範囲をカバーする必要がありました。 代わりに、大画面を使用して、相乗的な薬物ペアを決定するには浅いシーケンスデータで十分であることを示しました。 私たちは、相乗効果または拮抗効果を持つ薬物ペアの 420 の治療条件を含むデータセットをマイニングしました。 我々は、トラメチニブとトポイソメラーゼ2（Top2）阻害剤（ドキソルビシンまたはラゾキサン）を組み合わせると拮抗作用があることを発見しました（図6b）。 我々は、トラメチニブによるMAPK経路の阻害とその結果生じるG1細胞周期停止が、細胞がその後のS期に入るときにTop2阻害によって通常引き起こされるDNA損傷を打ち消すのではないかと仮説を立てています。 予測および検証された相乗効果の組み合わせの中で、トリシリビンとダカルバジン、および YM155 とイマチニブの組み合わせがトップヒットであることがわかりました (図 6b)。 BCR-ABL (イマチニブの標的) は、サバイビン (YM155 の標的) の発現の上方制御に以前から関連付けられていました 38。 したがって、サバイビンアンチセンスサイレンシングは、慢性骨髄性白血病（CML）細胞株およびCML患者由来の骨髄性前駆細胞において生存率を低下させ、イマチニブ治療の有効性を高めることが判明しました39,40。 イマチニブ耐性の発症を防ぐ可能性がある、以前に記載された CML の効果的な治療法の組み合わせを確認することで、臨床的に関連する薬剤ペアを特定する際の当社のパイプラインの可能性をさらに実証します。 さらに、遺伝子発現データからの生存率スコアと、プレートベースの薬物スクリーニングから得られた実験的に検証された相乗効果スコアとの間に良好な相関関係があることを検証しました。 これらの結果は、大規模なトランスクリプトームスクリーニングにおいて、費用対効果の高い低い配列決定深度を使用して、相乗的な薬物ペアを発見できることを示しています。

摂動下での推定された経路活性と併せて、これにより相乗的な組み合わせの同定が可能になるだけでなく、それらの作用機序についての洞察も得られるはずです。 以前の単一測定の表現型アッセイ プラットフォーム 14 と比較して、グローバル トランスクリプトーム リードアウトはサンプルあたり数桁多くのデータ ポイントを提供する一方で、細胞消費量はさらに約 6 分の 1 に削減できます。 より高い内容の読み出しにより、最良の併用療法に関するより確実な予測や、新しい薬剤感作物質やバイオマーカーの発見が可能になるはずであり、必要な材料がさらに少ないため、患者の層別化や治療の優先順位付けのための臨床での応用がさらに容易になります。

バルブモジュールに使用されるすべてのデバイスは、製造元の指示に従って、AZ-40XT ポジ型フォトレジスト (Microchemicals) を使用したソフトリソグラフィーを使用して準備された型から複製されました。 25400 dpi フォトマスク (Selba) の構造は、波長 375 nm の光を使用してマスク アライナー (Suess MicroTec MJB3) で 4 インチ シリコン ウェーハ (Siltronix) 上にパターン化されました。 構造を、硬化剤（Sylgard 186 エラストマーキット、Dow Corning Inc）と 1:10 の比率で混合した PDMS の厚さ約 1 cm の層で覆い、65 °C で一晩硬化させました。 さらに、PDMS と硬化剤を 1:10 の比率で混合し、500 rpm のスピンコーター (Laurell WS 650) を使用して透明シート上に分散させて PDMS 膜を調製し、65 °C で一晩硬化させました。 バルブチップの薬剤入口ポートと廃棄ポートは、0.75 mm 生検パンチ (Harris Unicore) を使用して穴を開けましたが、プラグ出口ポートは、0.5 mm 生検パンチ (Harris Unicore) を使用して出口チャネルに対して水平に穴を開けました。 プラズマオーブン(Diener Femto)を使用して、チップをPDMS膜に結合させた。 内径 0.4 mm の PTFE チューブ (Adtech) を、チューブが出口チャネルの漏斗状構造に達するまで、水平に打ち抜かれた出口ポートに挿入しました。 続いて、入口と出口を備えたチップ構造を支持するために、チップをスライドガラスに結合させた。 表面の濡れを防ぐために、使用前にチャネルを Aquapel (PGG Industries) で処理しました。 点字チップのバルブ構造は、点字ディスプレイ（KGS Corporation、補足図21a）のピンの上に位置合わせされ（補足図2a）、プレキシガラスホルダーを使用して取り付けられました（補足図21b）。 当社の「CombinatorialPlugFluidics」LabVIEWTM 2013 ソフトウェアを使用します (必要なソフトウェアはすべて www.epfl.ch/labs/lbmm/downloads からダウンロードできます)。 ピンの動きが制御され、収集チャネルが開くと廃棄チャネルが閉じられ、その逆も同様でした。 チャネルの閉鎖は、ピンを弾性 PDMS 膜に押し込むことによって達成されました。 これは、ピンを下に動かすと再び開くことができます。 すべての実験では、5 ml の薬物バーコード溶液を満たした 20 本のシリンジ (Becton Dickinson) と 5 ml の HFE オイル (Novec™ 7500、3 M) を満たした 4 本のシリンジを使用しました。 これらをPTFEチューブでバルブチップの入口ポートに接続し、シリンジポンプ(Harvard Apparatus)を使用して流体を500μl h-1で注入した。 廃棄物出口は PTFE チューブで接続され、流体を廃棄物容器に導きました。

ドロップメーカー型は、製造業者（Microchemicals）の説明に従ってネガ型フォトレジスト SU-8 2075 から製造されました。 10% (w/w) 硬化剤を含む PDMS を型の上に注ぎ、一晩硬化させました。 細胞および HFE の入口ポートは、オートサンプラーの接続からの PEEK チューブ用の 0.75 または 1 mm 生検パンチを使用して垂直に穴あけされました。 点字バルブからの複合プラグの入口ポートは、0.5 mm パンチを使用して水平に穴を開けられました。 チップは最初にPDMS膜に血漿結合され、続いてガラススライドに結合されました。 チャネル壁の疎水性は、Aquapel (PGG Industries) をチャネルに注入することによって増加しました。

マイクロタイタープレートからドロップメーカーデバイスへの薬剤の注入を容易にするために、96 ウェルプレートから薬剤を吸引する Dionex 3000SL オートサンプラーを使用しました。 オートサンプラーは、ウェルから 310 μl の化合物を 125 μl サンプルループに連続的に吸引するようにプログラムされました。 大過剰の吸引量により、ニードル容量は 60 μl、ループ オーバーフィル係数は 2 となりました。サンプル ループをその容量の 2 倍でオーバーフィルすることで、残りの化合物混合物がサンプル内に残っているキャリア流体によって希釈されないようにしました。洗浄による各サイクル後のサンプルループ。 サンプルループから液滴メーカーへの化合物の注入は、PBS (Thermo Fisher) を 500 μl h-1 で注入するシリンジポンプ (Harvard Apparatus) によって駆動されました。 1 つの薬剤を吸引した後、次の薬剤が吸引される前に、各薬剤が確実に注入され、点字ディスプレイのすべての薬剤と混合されるようにするための遅延時間が開始されました。

bgen ツール (gear.embl.de) を使用して、バランスのとれた塩基分布を持つランダムな 10 nt 長の DNA 配列を生成しました。 バーコード付き PCR プライマーは、精製のために 5' 末端ビオチンで官能化され、続いてスペーサー配列、共通プライマー配列、固有のバーコード配列、およびライゲーション部位が続きました (表 2)。 逆相補体 (RC) は、ライゲーションを可能にするために遊離 5' 末端リン酸で官能化されています。 バーコード化された RT プライマーは、dT(20)-VN 配列、固有のバーコード配列、および 5' 末端のリン酸基で構成されていました。 このためのＲＣは、ＰＣＲプライマーのライゲーション部位に相補的なライゲーション部位を有した。 すべてのバーコード シーケンスのリストは補足資料にあります。 サーマルブロック（エッペンドルフ）内で混合物を95℃に10分間加熱し、続いて室温（RT）に1時間冷却することにより、相補的配列を等モル濃度でアニーリングしました。

バルブモジュール用のバーコードと薬物の混合物は、バーコード付き RT プライマーを FreeStyle 培地 (Thermo Fisher) で 1 μM に希釈することによって調製しました。 DMSO に溶解した薬剤を、最終濃度の 2 倍で対応するバーコードに追加しました (補足資料を参照)。 バーコードと薬物の混合物には、モニタリング目的で Cascade-Blue (Thermo Fisher) または Alexa-488 (Thermo Fisher) のいずれかを 10 µM で追加し、その後 27 G を使用して PTFE チューブに接続された 5 ml ルアーロック シリンジ (BD) に吸引しました。 3/4 針 (BD)。 オートサンプラーベースの注射用のバーコード薬物混合物は、バーコード付き PCR プライマーを FreeStyle 培地で 4 μM に、対応する薬物を最終濃度の 4 倍に希釈することにより、丸底 96 ウェル プレートで調製しました。 混合物に Alexa-488 を 10 μM で補充し、プレートを粘着性 qPCR シール (Thermo Fisher) でシールしました。

K562細胞（ATCC、CCL-243）を、10％FBS（Thermo Fisher）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Thermo Fisher）を補充したIMDM培地（Thermo Fisher）中で培養した。 実験当日、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％ＦＢＳを補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｍｅｄｉａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に再懸濁した。 細胞懸濁液の濃度を 2 × 106 細胞 ml-1 に調整し、その後 3 ml のルアーロック シリンジ (BD) に吸引しました。

薬物とバーコードの混合物とHFEオイルを含むシリンジを図1cに示すように点字バルブチップに接続し、すべて500μl h-1で注入しました。 すべての複合バルブのデフォルト モードは、流体を廃棄出口に導き、2 つの HFE オイル バルブで流体を出口チューブに導くことでした。 点字バルブの出口チューブの長さは、HFE オイルで間隔をあけて配置された 20 個の複合プラグすべてを収容するように調整され、ドロップ マーカー チップの点字入口に接続されました (補足図 21b)。 細胞を含むシリンジをポンプに取り付け、ドロップメーカーに接続し、500 μl h-1で注入しました。 細胞の沈降は、Multi Stirrus™ システム (VP Scientific) を使用した磁気ディスクの低速回転によって防止されました。 オートサンプラー出力チューブと 1% Pico-Surf1 (Sphere Fluidics) を補充した HFE キャリア相をそれぞれの入口を介して接続し、それぞれ 500 および 6000 μl h-1 で注入しました。 液滴メーカーチップは、複合プラグまたは液滴の蛍光強度を測定するための光学セットアップを備えた顕微鏡（Nikon、Eclipse Ti2-E）に取り付けられました14。 波長 375 または 488 nm のレーザーを使用して色素を励起し、放出された光 (450 または 520 nm) を光電子増倍管を使用して測定しました。 レーザーは、図1cに示す3つの位置（M1〜M3）の1つに焦点を合わせて、薬物とバーコードの混合物と一緒にドロップメーカーに注入された蛍光色素を測定しました。 M1 および M2 の位置で、PlugAcquisition LabViewTM 2014 ソフトウェアを使用して蛍光シグナルを記録しました。 液滴からの蛍光シグナルは、DropletAcquisition LabViewTM 2014 ソフトウェアを使用して位置 M3 で取得しました (必要なソフトウェアはすべて www.epfl.ch/labs/lbmm/downloads からダウンロードできます)。

点字バルブの開閉シーケンス (表 3) を含む CSV ファイルがサンプルのオンデマンド ソフトウェアにロードされました。 点字弁からの 20 種類の薬剤すべてと 96 ウェル プレートからの 21 種類の薬剤を組み合わせていたため、サイクル数は 21 に設定されました。 すべてのチューブが接続され、液体がドロップ マーカーに注入されると (オートサンプラーからのキャリア液と点字バルブからの HFE オイル)、プラグの製造とオートサンプラーによる注入が同時に開始されました。 20 個のプラグを遅延チューブ内に生成し (180 秒)、その後 2 つの HFE オイルバルブを開くことによってドロップメーカーに注入しました (総流量 1000 μl h-1)。 これにより、プラグ注入の連続的かつ安定した流量が保証され、その結果、点字バルブ、オートサンプラー化合物、およびフロー集束接合部で液滴が生成されるセルからの化合物の層流が生成されました (ムービー S1)。 約800μlの液滴をエッペンドルフチューブに集め、氷上に保管した。 420 の組み合わせが生成されたら (約 100 分)、エッペンドルフ チューブを 37 °C、5% CO2 雰囲気の加湿インキュベーターに置き、細胞を 12 時間インキュベートしました。

ピコインジェクション用のチップは、上記の硬化剤を含む PDMS を使用して SU-8 モールドを複製することによって製造されました。 キャストをスライドガラスに血漿結合させ、Aquapel で処理しました。 チップを95℃に加熱し、最初の低融点はんだと2番目のケーブルを2つの電極のポートに挿入しました（補足図22）。 チップはマイクロ流体ステーションの顕微鏡に取り付けられ、電源電極は高電圧増幅器に接続され、チップは接地電極上で接地されました。

12時間のインキュベーション後、細胞、薬物の組み合わせ、および対応するDNAバーコードを含む液滴を3 mlのシリンジに移し、液滴注入口からピコインジェクションチップに注入しました（補足図2）。 液滴を 180 μl h-1 でフラッシュし、1% PicoSurf 界面活性剤を含む HFE オイルを 700 ～ 1000 μl h-1 でオイル注入口に注入することにより、個々の液滴の間隔をあけました。 細胞溶解、バーコードライゲーション、および溶解細胞から放出された mRNA の逆転写のために、0.9% Igepal (Sigma Aldrich)、3x ライゲーションバッファー (NEB)、60,000 U/μl T4 リガーゼ ( NEB)、1.5 mM dNTP (Thermo Fisher)、7.5 μM テンプレート スイッチング オリゴヌクレオチド (IDT)、12 U/μl Maxima -H 逆転写酵素 (Thermo Fisher)、および 6000 U/μl NxGen RNase Inhibitor (Lucigen)。 最終的な液滴体積の 1/3 に相当する量を注入するために、試薬混合物の流量を液滴の頻度とサイズに応じて調整しました (ムービー S3)。 インジェクター ノズルを通過する液滴に試薬を注入するために、関数発生器 (Rigol) を使用して 0.1 V の連続電界を印加しました。 ピコインジェクションは約 1 時間かけて実行され、その間すべての液滴 (注入および収集) は氷上に保管されました。 続いて、エマルジョンを室温で 30 分間保持し、その後 42 °C で 90 分間インキュベートしました。

薬物交換実験は、記載されている組み合わせ薬物スクリーニングと同様に、小さな調整を加えて実行されました。異なる薬物はオートサンプラーからのみ注入され、BC-15 または BC-O および DMSO を補充した培地のみが、通常の注射器を使用して点字注入口から連続的に注入されました。点字ディスプレイの代わりにポンプを使用します。 すべてのサンプルのエマルジョンを 96 ウェル プレートの個々のウェルに収集し、5% CO2 雰囲気下、37 °C で 24 時間インキュベートし、プールし、組み合わせ薬物スクリーニングについて説明したように処理しました。

まず、10 μl の BC-PCR と 5 μl BC-RT (両方とも 20 μM) を 96 ウェル プレートのそれぞれのウェルに添加し、続いてイマチニブの対応する 50 倍薬物ストックの 1 つであるトラメチニブから 4 μl を添加しました。 、またはYM155（表S4）。 K562細胞を1%(wt/vol)FBSを含むFS培地に1050細胞/μlの濃度まで再懸濁した。 薬物とバーコードの混合物を含む各ウェルに、この細胞懸濁液 181 μl を加え、5% CO2 雰囲気下、37 °C で 12 時間インキュベートしました。 効率を高めるために、逆転写を実行する前に、最初に細胞の溶解とライゲーションを実行し、続いて精製と洗浄のステップを実行しました。 具体的には、20 μl の細胞を、10 μl の 0.9% Igepal (Sigma Aldrich)、3x ライゲーションバッファー (NEB)、60,000 U/μl T4 リガーゼ (NEB)、および 6000 U/μl NxGen RNase Inhibitor を含むウェルに移しました。 (Lucigen) 細胞溶解 (氷上で 10 分) およびバーコードライゲーション (RT で 30 分)。 約２００μｌの６×ＳＳＣを混合物に加えた後、混合物を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、２０００×ｇで５分間遠心分離した。 上清を、6×SSC緩衝液中10μgμl-1のC1ダイナビーズ50μlを補充した新しいエッペンドルフチューブに移し、ニューテーター（VWR）上で室温で15分間インキュベートした。 ビーズを 6x SSC バッファーで 3 回洗浄し、ベンチトップ遠心機で簡単に遠心分離し、1x Maxima RT バッファー (Thermo Fisher)、4% Ficoll-PM 400 (Sigma Aldrich)、1 を含む逆転写ミックス 80 μl に再懸濁しました。 mM dNTP、2000 U/μl NxGen RNase Inhibitor (Lucigen)、2.5 μM テンプレート スイッチング オリゴヌクレオチド (IDT)、および 4 U/μl Maxima -H 逆転写酵素 (Thermo Fisher)。 混合物を章動（VWR）下で室温で30分間、および42℃で90分間インキュベートした。 ビーズを TE-SDS (10 mM Tris pH 8.0、1 mM EDTA、および 0.5% SDS) で 2 回、ヌクレアーゼフリー水 (Thermo Fisher) で 2 回洗浄した後、さまざまな条件からの cDNA をプールし、 に記載されているようにライブラリー調製のために処理しました。 「ライブラリの準備とシーケンス」のセクションを参照してください。

K562細胞は、「細胞懸濁液の調製」のセクションに記載されているように培養されました。 実験当日、細胞を PBS で洗浄し、1% FBS を添加した FreeStyle Media (Thermo Fisher) に再懸濁しました。Combi-seq と PolyA ベースの RNA 捕捉戦略を比較するために、250 細胞/μl をサンプルに移しました。エッペンドルフチューブに、FreeStyle Media、1% FBS に懸濁した Combi-Seq または PolyA-Seq バーコードとともに、対応する薬物または DMSO を含む 5 μl 溶液と混合し、37 °C、5% CO2 雰囲気で 16 時間インキュベートした後、液滴実験と同様に、細胞を、溶解バッファー、リガーゼ、および逆転写酵素を含む溶液 15 μl と混合しました（詳細については、「細胞溶解、バーコードライゲーションおよび逆転写のためのピコインジェクション」セクションを参照）。

ERCC スパイクイン (Thermo Fisher、カタログ番号 4456739) を RNase フリー水で 1:100 に希釈しました。 次いで、30μlの希釈ERCCスパイクインを合計600μlのワンポット反応混合物に添加した。 この反応混合物は、「細胞溶解、バーコードライゲーションおよび逆転写のためのピコインジェクション」セクションに記載されているように、液滴に対して 1:3 の比率でピコインジェクションされました。

mRNA の逆転写の際、薬物処理に従ってすべての cDNA がバーコード化されるため、0.5 ～ 1 ml の 1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクタノール (Abcr) を加えてエマルジョンを破壊しました。 上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、6x SSC バッファー (Thermo Fisher) 中の 1x 容量の C1 dynabeads (Thermo Fisher) を 2.5 μg μl-1 添加し、室温で 20 分間インキュベートしました。 ビーズをTE-SDS (10 mM Tris pH 8.0、1 mM EDTA、および0.5% SDS)中で2回、およびヌクレアーゼフリー水(Thermo Fisher)中で2回洗浄した。 ビーズを 5 μg μl-1 で再懸濁し、続いてメーカーの指示に従って MseI (NEB) 消化しました。 上清を SPRIselect ビーズ (BD) を使用して 2 回、最初は cDNA の 0.6 倍、次に 0.8 倍の量で精製し、最後に 0.8 μM の SMART プライマー (補足表 3) を含む KAPA HiFi Ready Mix (Roche) で増幅しました。合計 13 サイクル (補足表 4 の PCR プログラム)。 生成物は、0.6x 容量の SPRIselect ビーズで精製し、2100 Bioanalyzer (Agilent) の高感度 DNA チップを使用して分析しました。 cDNAの断片化を行って断片を短くし、リンカー配列を導入しました。 これは、house41 で開発された 3' 末端ライブラリーの Tn5 ベースのタグメンテーション プロトコルを使用して達成されました。 断片は、KAPA HiFi Ready Mix 中の 0.75 μM で P5-SMART プライマー (補足表 3) および i7 インデックス付き P7 アダプタープライマー (Illumina、補足表 3) を使用して増幅されました (PCR プログラム、補足表 4)。 フラグメントは 1x 容量の SPRIselect ビーズで精製され、バイオアナライザーを使用してサイズ分布が決定されました。 すべての複製を等モル比でプールし、NextSeq 500 (Illumina) マシンで 10% PhiX スパイクインとともに配列決定しました。 ペアエンドシーケンスは、シーケンスカスタムプライマー (補足表 3) と mRNA (リード 2、59 bp) を使用してバーコードの組み合わせ (リード 1、26 bp) をシーケンスすることによって実行されました。

箱ひげ図では、中心線は測定された中央値を表し、上部のボックスと下部のボックスのヒンジは第 1 四分位数と第 3 四分位数に対応します。 ボックスの上下のヒンジから伸びるひげは、1.5 倍の四分位範囲を表します。 図2dのバイオリンプロットに示されている点と線は、測定された各相互汚染の平均と標準偏差に対応します。

遺伝子発現の前処理と品質管理には SCANPY パイプライン 42 を使用しました。 遺伝子数が少なく、ミトコンドリア遺伝子の割合が高い (>15 パーセント) サンプルと、ドロップアウト率の高い遺伝子がフィルターで除外されました。 読み取り数は、シーケンスの深さと変換された Z スコアに基づいて正規化されました。 SCANPYの戦闘機能を使用してバッチ効果(複製)を削除しました。 次元削減には、主成分分析を使用し、続いて t 分布確率的近傍埋め込み (TSNE)43 を使用しました。 追加のデータ分析は、NumPy44 とパンダを statsmodels ライブラリとして使用し、カスタム Python 3.7 スクリプトで実行されました。

さまざまな要因 (オートサンプラー薬剤、点字バルブ薬剤、組み合わせ) に基づいてサンプルのクラスタリングを分析するために、シルエット スコア分析を使用しました。 各サンプルのシルエット係数 (b − a)/max(a,b) を計算しました。ここで、a は平均クラスター内距離、b は平均最近接クラスター距離です。 各クラスタリング係数について、シルエット係数の平均が計算されました (scikit-learn Python ライブラリ)。 シルエット スコアはクラスターの数に依存するため、サンプル ラベルを並べ替えることによりランダムなクラスターを作成し、クラスター メンバーシップを作成しました。

パスウェイ活性は、PROGENy 法を使用して計算されました 17、18、19。 個々の薬物特異的な経路活性は、線形モデル (pathway_activity ~ YM155 + イマチニブ + トラメチニブ) をフィッティングすることによって計算されました。

ハイスループット スクリーニングと LINCS-L1000 データセット 8 からの遺伝子発現シグネチャの類似性を比較するために、ハイスループット スクリーニングの各薬剤のコンセンサス シグネチャを計算しました。 コンセンサスシグネチャを計算するために、発現行列の各遺伝子に線形モデル (gene_expression ~ Drug1 + Drug2 + … + Drugn) を当てはめ、線形モデルの係数を薬剤固有のシグネチャとして使用しました。 シグネチャの類似性を比較するために、ハイスループット スクリーニングの薬剤シグネチャと LINCS-L1000 シグネチャの間のスピアマンの順位相関係数を計算しました。 類似性値は ROC 分析の予測値として使用され、真陽性はハイスループット スクリーニングと LINCS-L1000 の間で一致した薬物ペアでした。

細胞生存率の予測には、CEVIChE メソッドを使用しました。 CEVIChE は、一致する細胞生存率と遺伝子発現データセットの大規模な組み合わせでトレーニングされた線形モデルに基づいて、遺伝子発現の変化から細胞生存率を予測します18。 ハイスループット スクリーニングで測定された遺伝子は、元の CEVIChE モデルで使用された遺伝子との重複が低いことが示されたため、ハイスループット スクリーニングで測定された遺伝子のみを使用して CEVIChE を再トレーニングしました。 この再トレーニングされた CEVIChE モデルは、元の方法と同等のパフォーマンス (細胞生存率の予測と観察の間のピアソン相関: 0.31) を示しました。

細胞の添加後、各薬物がそのGR35濃度およびその4倍希釈系列で存在するように、各組み合わせについて4×4のチェッカーボードで薬物プレートを事前に調製した。 各プレートには、培地、DMSO 陰性対照、および各薬物の単剤療法も含まれていました。 K562細胞を各実験の前日に継代した。 実験当日、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、その後、１％ＦＢＳを含むＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に再懸濁した。 マルチチャンネルピペットのマルチステップ機能を使用して、各ウェルの最終容量が 200 μL、細胞数が約 2 × 104 になるように、あらかじめ調製した各薬物プレートに細胞を追加しました。 細胞を吸引するためのリザーバーには、細胞が懸濁液中に確実に残るように、新たに再懸濁したストック溶液を頻繁に再充填した。 プレートをガス透過性ホイル(Sigma)で密閉し、48時間インキュベートした。 蒸発を防ぐために、プレートは、約 1 cm の水が入ったボックス内のインキュベーター内に保管し、ボックス内でプレートをチップボックス上に置きました。 インキュベーション後、22 μL PrestoBlue (Thermo Fisher) 細胞生存率試薬を各ウェルに添加し、プレートを再度密閉し、インキュベーターに戻して 1 時間放置しました。 次いで、５３５／６１５ｎｍの励起／発光波長（それぞれ２０および１０ｎｍの波長帯域幅）を有するＴｅｃａｎマイクロプレートリーダーを使用してプレートを読み取った。 単剤療法で測定された細胞生存率に基づいて、Bliss 独立モデル 24 を使用して、各組み合わせ、各濃度ペアの予想細胞生存率を計算しました。 組み合わせの予想細胞生存率と測定細胞生存率の差をすべての濃度にわたって平均し、相乗効果スコアとして与えました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究で生成された RNA シーケンス データは、アクセッション コード GSE174696 で GEO データベースに保管されています。 マイクロ流体ステーションで取得された蛍光分光測定データと、この研究で生成されたプレート内の細胞の生存率測定値は、ソース データ ファイルで提供されます。 この研究で使用された薬剤の logD 値は、ChEMBL データベースで入手できます 45。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

マイクロ流体制御ソフトウェアは、www.epfl.ch/labs/lbmm/downloads からダウンロードできます。 マイクロ流体チップの CAD ファイルは、Zenodo から入手できます: https://zenodo.org/record/6845607#.YtWZlMFBz1K。 トランスクリプトーム データの分析に使用されるコードは、https://github.com/saezlab/Combi-Seq-analysis46 からダウンロードできます。

Marquart, J.、Chen, EY & Prasad, V. ゲノム主導腫瘍学の恩恵を受ける米国のがん患者の割合の推定。 JAMAオンコル。 4、1093–1098 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Letai、A. 機能的精密がん医学 - 純粋なゲノミクスを超えて。 ナット。 医学。 23、1028–1035 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Cetin、AE et al. 単一細胞塊の蓄積による多発性骨髄腫の治療感受性の決定。 ナット。 共通。 1613 年 8 月 (2017 年)。

論文 ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Gao、H.ら。 臨床試験の薬物反応を予測するための、患者由来の腫瘍異種移植片を使用したハイスループット スクリーニング。 ナット。 医学。 21、1318–1325 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

モンテロ、J. et al. 薬物誘発性死シグナル伝達戦略は、化学療法に対するがん反応を迅速に予測します。 セル 160、977–989 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

メンデン議員ら。 薬理ゲノムスクリーニングにおける抗がん剤の組み合わせのコンピューターによる予測を進めるためのコミュニティ評価。 ナット。 共通。 10、2674 (2019)。

論文 ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

イオリオ、F.ら。 がんにおける薬理ゲノム相互作用の風景。 セル 166、740–754 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Subramanian、A. et al. 次世代接続マップ: L1000 プラットフォームと最初の 1,000,000 プロファイル。 セル 171、1437–1452 e1417 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ブッシュ、ＥＣら。 ハイスループットスクリーニングのゲノムワイド制御ネットワーク解析のための PLATE-Seq。 ナット。 共通。 8、105（2017）。

論文 ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

そう、C.ら。 創薬における小型化されたハイスループットのトランスクリプトームプロファイリングのための DRUG-seq。 ナット。 共通。 9、4307 (2018)。

論文 ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Srivatsan、SR et al. 単一細胞解像度での大量多重化学トランスクリプトミクス。 サイエンス 367、45–51 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

マクファーランド、JM 他がんの脆弱性と治療の作用機序を定義するための多重単一細胞転写応答プロファイリング。 ナット。 共通。 11、4296 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Clausell-Tormos、J. et al. 哺乳類細胞および多細胞生物のカプセル化およびスクリーニングのための液滴ベースのマイクロ流体プラットフォーム。 化学。 バイオル。 15、427–437 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

エドゥアティ、F.ら。 がん生検における併用薬剤スクリーニングのためのマイクロ流体プラットフォーム。 ナット。 共通。 9、2434 (2018)。

論文 ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Abate, AR、Hung, T.、Mary, P.、Agresti, JJ & Weitz, DA ピコインジェクターを使用したマイクロ流体によるハイスループット注入。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 107、19163–19166 (2010)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ミラー、OJら。 液滴ベースのマイクロフルイディクスを使用した高解像度の用量反応スクリーニング。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 109、378–383 (2012)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

シューベルト、M.ら。 摂動応答遺伝子は、がん遺伝子発現におけるシグナル伝達フットプリントを明らかにします。 ナット。 共通。 9、20 (2018)。

論文 ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Szalai、B.ら。 摂動トランスクリプトミクスデータにおける細胞死と増殖の特徴 - 交絡因子から効果的な予測まで。 核酸研究所 47、10010–10026 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ホランド、CH et al. 単一細胞 RNA-seq データに対する転写因子および経路解析ツールの堅牢性と適用性。 ゲノムバイオル。 21、36 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Janjic、A. et al. Prime-seq、効率的かつ強力なバルク RNA シーケンス。 ゲノムバイオル。 23、88 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Svensson、V. et al. 単一細胞 RNA シーケンス実験の検出力解析。 ナット。 方法 14、381–387 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

グルーナー、P. et al. 最小限のエマルションでの分子輸送の制御。 ナット。 共通。 7、10392 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hafner, M.、Niepel, M.、Chung, M. & Sorger, PK 増殖速度阻害指標は、抗がん剤に対する感受性を測定する際の交絡因子を補正します。 ナット。 方法 13、521–527 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ホルベック、SL et al. National Cancer Institute ALMANAC: 治療活性が強化された抗がん剤の組み合わせを検出するための包括的なスクリーニング リソース。 がん研究所 77、3564–3576 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

パエス、JG et al. 肺がんにおけるEGFR変異：ゲフィチニブ療法に対する臨床反応との相関。 サイエンス 304、1497–1500 (2004)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

リンチ、TJ 他ゲフィチニブに対する非小細胞肺がんの反応性の根底にある上皮増殖因子受容体の活性化変異。 Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 350、2129–2139 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アイヤー、G.ら。 ゲノム配列決定により、エベロリムス感受性の根拠が特定されます。 サイエンス 338、221 (2012)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ディートリッヒ、S. et al. 薬物摂動に基づく血液がんの層別化。 Ｊ．クリン． インベストメント 128、427–445 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

ガーネット、MJ 他がん細胞における薬剤感受性のゲノムマーカーの体系的な同定。 ネイチャー 483、570–575 (2012)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ヴァン・アレン、EM 他転移性黒色腫における RAF 阻害に対する臨床抵抗性の遺伝的状況。 キャンサーディスコ。 4、94–109 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Dagogo-Jack, I. & Shaw, AT 腫瘍の不均一性と癌治療に対する耐性。 ナット。 クリン牧師。 オンコル。 15、81–94 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Al-Lazikani, B.、Banerji, U.、Workman, P. ポストゲノム時代の癌に対する併用薬物療法。 ナット。 バイオテクノロジー。 30、679–692 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Sart, S.、Tomasi, RF、Amselem, G. & Baroud, CN マルチスケールサイトメトリーとチップ上の 3D 細胞培養の制御。 ナット。 共通。 8、469 (2017)。

論文 ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Headen, DM, García, JR & García, AJ ハイスループットの細胞カプセル化と合成ミクロゲル生成のための並列液滴マイクロ流体工学。 マイクロシスト。 ナノエン。 4、17076 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

阿部 洋 他非常に強力で選択的な MEK 阻害剤の発見: GSK1120212 (JTP-74057 DMSO 溶媒和物)。 ACS医学。 化学。 レット。 2、320–324 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィートリー、SP、アルティエリ、DC サバイビンの概要。 J. Cell Sci. https://doi.org/10.1242/jcs.223826 (2019)。

Zhang、Y.ら。 Sp1 および c-Myc は、ERK-MSK MAPK シグナル伝達経路を介してサバイビン発現を調節することにより、白血病幹細胞の薬剤耐性を調節します。 モル。 がん 14、56 (2015)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Wang, Z.、Sampath, J.、Fukuda, S. & Pelus, LM アポトーシス阻害剤タンパク質サバイビンの破壊は、Bcr-abl 陽性細胞を STI571 誘発アポトーシスに対して感受性を高めます。 がん研究所 65、8224–8232 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ステラ、S.ら。 BCR-ABL/JAK2/STAT3経路によって誘導されるサバイビンの抑制は、イマチニブ耐性CML細胞をさまざまな細胞傷害性薬剤に対して感作させます。 モル。 がんサー。 12、1085–1098 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

カーター、BZら。 Bcr-Abl/MAPK カスケードによるサバイビン発現の制御: サバイビンを標的とすることでイマチニブ耐性が克服され、イマチニブ応答性 CML 細胞におけるイマチニブ感受性が増加します。 Blood 107、1555–1563 (2006)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hennig、BP et al. 堅牢な Tn5 精製およびタグメンテーションプロトコルを使用した、大規模で低コストの NGS ライブラリーの調製。 G3 8、79–89 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wolf, FA、Angerer, P. & Theis, FJ SCANPY: 大規模な単一細胞遺伝子発現データ分析。 ゲノムバイオル。 19、15 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Kobak, D. & Berens, P. 単一細胞トランスクリプトミクスに t-SNE を使用する技術。 ナット。 共通。 10、5416 (2019)。

論文 ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

ハリス、CR 他。 NumPy を使用した配列プログラミング。 ネイチャー 585、357–362 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

デイビス、M.ら。 ChEMBL Web サービス: 創薬データとユーティリティへのアクセスを合理化します。 核酸研究所 43、W612–W620 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Szalai, B. 単一細胞液滴の決定論的バーコーディングを使用した薬物組み合わせの多重トランスクリプトームベースのプロファイリングのための Combi-Seq。 GitHub https://doi.org/10.5281/zenodo.6761914 (2022)

リファレンスをダウンロードする

ライブラリーの準備とサンプルの配列決定にご協力いただいたEMBLのゲノミクスコア施設のメンバー全員、点字バルブのコントローラーとホルダーを構築してくれたEMBL電子機械ワークショップ、マスクアライナーを保守してくれたEMBL SIM、Bart Deplancke、およびCathrin Brisken には原稿に関するフィードバックを提供していただき、Merten ラボの現在および以前のメンバー全員にはディスカッションとフィードバックを提供していただきました。 BS は、ハンガリー科学アカデミーのプレミアム フェローシップ プログラム (460044) に感謝します。

B. ザライ

現在の住所: Turbine Simulated Cell Technologies Ltd、ブダペスト、ハンガリー

これらの著者は同様に貢献しました: L. Mathur、B. Szalai。

ゲノム生物学ユニット、欧州分子生物学研究所 (EMBL)、ハイデルベルク、ドイツ

マサー L、ウタララ R、バリンジャー M、ランドリー JJM、ベネス V、メルテン CA

EMBLとハイデルベルク大学生命科学部（ドイツ、ハイデルベルク）間の共同博士号取得に向けた協力

L.マチュール

センメルワイス大学医学部生理学教室、ブダペスト、ハンガリー

B. ザライ

自然科学研究センター、酵素学研究所、ブダペスト、ハンガリー

B. ザライ

スイス連邦工科大学 (EPFL)、ローザンヌ、スイスの工学部生物工学研究所

NH ドゥ & CA メルテン

ストラスブール大学、CNRS、RNA アーキテクチャおよび反応性、UPR、9002、ストラスブール、フランス

M・リッケリンク

医学部およびハイデルベルク大学病院、ハイデルベルク大学計算生物医学研究所、ハイデルベルク、ドイツ

J・サエス・ロドリゲス

医学部、計算生物医学共同研究センター (JRC-COMBINE)、アーヘン工科大学、アーヘン、ドイツ

J・サエス・ロドリゲス

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

LMは、CAMBSの監督の下でマイクロ流体プラットフォームとバーコーディングアプローチを概念化し、開発し、実験を設計して実行し、データを分析しました。JS-RNHDの監督の下でデータの計算機解析を考案して実行し、実験を設計して実行し、データを分析しました。 RU は、マイクロ流体プラットフォームに使用される LabVIEW ソフトウェアを作成しました。 MB はプレートベースの検証実験を実施しました。 JJML は、ピコインジェクション手順の開発をサポートする VBMR の監督の下でシーケンス データを処理しました。 LM と BS は結果を解釈し、NHD、CAM、JS-R の助けを借りて原稿を書きました。 原稿を見直して編集しました。

J・サエズ・ロドリゲスまたはCAメルテンへの通信。

LM、RU、および CAM は、ここで説明されているバーコーディング戦略およびマイクロ流体法を対象とする特許出願の発明者です (WO2016207441A1)。 JS-R. は GSK およびサノフィから資金提供を受け、Travere Therapeutics および Astex Pharmaceuticals からコンサルタント料を受け取りました。 BS は、ハンガリーのブダペストにある Turbine Ltd. のフルタイム従業員です。 残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Jeremy Jenkins 氏、Angela Wu 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Mathur、L.、Szalai、B.、Du、NH 他。 Combi-seq は、単一細胞液滴の決定論的バーコーディングを使用した薬物組み合わせの多重トランスクリプトームベースのプロファイリングを可能にします。 Nat Commun 13、4450 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32197-0

引用をダウンロード

受信日: 2021 年 5 月 26 日

受理日: 2022 年 7 月 21 日

公開日: 2022 年 8 月 1 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32197-0

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

ネイチャープロトコル (2022)

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティ ガイドラインに従うことに同意したことになります。 虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。