バイオコンクリートバイオインクを使用したその場 3D バイオプリンティング

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 13、記事番号: 3597 (2022) この記事を引用

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15 オルトメトリック

メトリクスの詳細

in-situ バイオプリンティングは、特に緊急時に負傷する可能性のある兵士、スポーツ選手、ドライバーなどの職業にとって、欠陥のある臓器に治療用バイオインクを直接堆積して修復できる点で魅力的です。ただし、従来のバイオインクには、複雑な動作環境では明らかな限界があります。ここでは、エレクトロスプレーされた細胞を含むミクロゲルを凝集体として、ゼラチンメタクリロイル (GelMA) 前駆体溶液をセメントとして使用して、バイオコンクリートバイオインクを設計します。光架橋されたミクロゲル凝集体の堅牢なレオロジー特性と GelMA セメントの流動性の恩恵を受け、幅広い温度範囲で有望な印刷適性が保証されます。複合コンポーネントは、生体適合性とさまざまな組織機械的微環境に同時に自己適応します。組織とヒドロゲルの界面での強力な結合は、セメントが光架橋される際の水素結合と摩擦によって達成されます。携帯性に優れ、緊急の事故時にも簡単に準備できるバイオインクです。一方、マイクロゲルは培養して小さな組織にし、その後バイオインク凝集体として混合することができ、これは当社のバイオコンクリートが通常のバイオインクよりも早く機能化できることを示しています。頭蓋欠損修復の結果は、このバイオインクの優位性と、現場での治療に必要な臨床現場におけるその可能性を証明しています。

新たな臓器欠損の治療法として、「in-situ バイオプリンティング」1 が最初にキャンベルによって提案されました 2。クリニックでも注目を集めています。簡単に言うと、治療用バイオインクは、外科用バイオプリンターによって患者の 3D 形態に応じた経路に沿って患者の創傷に直接塗布されます 3。現在、同様の方法を主に in vitro バイオプリンティングに利用しており、皮膚、軟骨、骨の治療に応用されています4。 in vitro 3Dバイオプリンティングに基づく臓器移植と比較して、その場での堆積機能により多くの利点があります（補足注1）。

しかし、in-situ バイオプリンティングは初歩的なものであり、臨床応用には制限があります。信頼性の高い in-situ バイオプリンターが存在しない 4 ことに加えて、主な理由の 1 つは、特別な要件を満たす適切なバイオインクが少ないことです。既存の関連研究では、適用されるバイオインクは、in vitro バイオプリンティングにおけるバイオインク、つまり前駆体溶液とほぼ同様であり、in-situ バイオプリンティングには有望な選択肢ではありません。 (i) 現場バイオプリンティングのほとんどの場合、バイオインク、特に感熱性バイオインクのレオロジー特性を厳密に制御する条件はありません。 (ii) in-vitro バイオプリンターのきれいな表面と制御可能な温度を備えた受け取り基盤とは異なり、in-situ バイオプリンティングには特別な受け取り基盤、つまり一定の温度 (37 °C) に保たれた患者の創傷と血液があり、印刷された画像が崩壊する可能性があります。架橋前の構造。 (iii) 架橋バイオインクは、カプセル化された細胞が治療機能を発揮するために低い機械的弾性率を有する必要がある。 (iv) 構造物は欠陥に見合った高い機械的特性を備え、修復中の損傷から構造物自体を保護する必要がありますが、これは要件 (iii) との大きな矛盾につながります。複合構造の構築、つまり強力な足場を印刷してから軟質ヒドロゲルを鋳造することは、効果的な解決策となっています5、6、7、8。しかし、そのような複雑な印刷プロセスは、その場バイオプリンティングでは実現できません。 (v) 欠陥と印刷構造の界面に強い結合力が形成される必要がある。 (vi) 現場バイオインクは持ち運び可能であり、緊急時に負傷する可能性のある兵士、運動選手、運転手などの職業のために簡単に準備できるものでなければなりません。

マイクロゲルは、細胞療法 9、薬物放出制御 10、疾患モデリング 11 などで一般的なバイオプリンティング構造となっており、多くの製造方法が提案されています 12、13、14、15、16。最近、独立した機能単位に加えて、Burdick らによる Nature Reviews に掲載されたミクロゲルに関するレビューで、 2020 年の時点では、マイクロゲルの「二次バイオプリンティング」18、19、20、21 が将来的にバイオインク成分として広く応用されることが予測されています。 Algeらの最新の研究では、 2021 年に Science Advances に掲載された論文 22 では、印刷中のミクロゲルの消散プロセスに関する詳細な調査が発表されました。王ら。 9 つのアルギン酸ミクロゲルを注入してラットの臓器欠損を修復しました。バーディックら。 23,24 は集められたミクロゲルを押し出し、特定の 3D 構造を確立しました。すべての研究は、ミクロゲルの有望な生体適合性だけでなく、一定の応力以下ではエラストマーとして表示されるが、応力がさらに増加するとニュートン流体として流れるビンガム流体 25、26、27 に似たミクロゲルの独特のレオロジー特性からも恩恵を受けました。したがって、マイクロゲルベースのバイオインクは、複雑な要件に適応するまったく新しい臨床現場バイオプリンティングバイオインクとしてさらに設計される可能性があります。

この研究では、現場バイオプリンティング用のバイオコンクリートバイオインク (A-C バイオインク) を開発します。その名前は建設用コンクリートに由来し、その略語は 2 つの主要成分である骨材 (A) とセメント (C) に由来しています (図 1、補足ビデオ 1 および 2)。エレクトロスプレーされた GelMA ミクロゲル (500 μm) は、複雑な環境におけるビンガム流体と同様の堅牢なレオロジー特性を得るために、主成分 (A) として使用されます (補足ノート 3 および 4)。 GelMA 前駆体溶液 (光開始剤を含む) は、流動性と印刷適性を確保するために補助 (C) 成分として使用されます。光架橋複合構造は、それぞれ低い/高い機械的弾性率を備えた A/C 構造を所有しており、これにより、装填された治療細胞の生体適合性の維持と欠陥周囲の高い引張/圧縮応力の負担との間の矛盾が完全に解決されます。さらに、C 成分は創傷表面に容易に浸透し、光架橋後に欠陥とヒドロゲルの界面に高い内部摩擦と水素結合を形成します。便利なことに、このバイオインクは、エアコン成分を液体窒素中に保存できるため、持ち運びが可能であり、事故の際には加熱装置や体温で解凍できるためです。一方、マイクロゲルは混合する前に培養して小さな組織にすることができ、これは当社のバイオコンクリートバイオインクが従来のものよりも早く機能化できることを示しています。ラット頭蓋欠損の in-situ 治療結果は、将来の in-situ バイオプリンティングの臨床現場での可能性を検証します。

上のパネルは、建設用コンクリートからインスピレーションを得て提案された A-C バイオインクの特性を示しています。下のパネル (I ～ VI) は、A ～ C バイオインクの使用法を示しています。

GelMA の置換度 (DS) は、ゼラチンとメタクリル酸の比率を変えることで簡単に変更できます。 DS および前駆体溶液の濃度が高いほど、光架橋構造の機械的特性が高くなります 28,29。当社の経験によれば、5% (w/v) low-DS GelMA (EFL-GM-30) は機械的特性が低く、生体適合性が高いです。したがって、非常に均一な直径を有することが確認された GelMA ミクロゲル (A30/5、500 μm) をエレクトロスプレーすることが選択されました (補足注 4 および補足図 6)。 20% (w/v) 高 DS GelMA (EFL-GM-300) は骨組織などの圧縮応力に耐えますが、20% (w/v) 低 DS GelMA (EFL-GM-30) は伸長に耐えます。腱組織などのストレス。そこで、C成分(C300/20、C30/20)として選定した。比較のために、5% (w/v) low-DS GelMA (EFL-GM-30) も C 成分 (C30/5) として選択しました。

我々は、C 成分が A 成分間の空隙に正確に浸透し、ミクロゲルが架橋前の崩壊を回避するのに十分な内部摩擦を生成できると仮定しました。細胞ふるいに蓄積したA30/5（GFPあり）をC30/5（RFPあり）に繰り返し浸し、持ち上げて余分なC30/5を濾過しました（図2a）。 C30/5 は毛細管力によって A30/5 間の空孔に自発的に入りました。架橋されたA-Cバイオインクは、A成分が互いに密接に結合していることを示しました（図2b、c）。 A 成分の体積割合は、赤/緑の領域で 73.215 ± 2.312% (補足注 2) として分析されました。これは、結晶化学における六方最密充填 (HCP) の原子空間利用率 (74.05%) と同様でした (図 2d)。 A 成分は、液体 C 成分中の浮力と表面張力の下で標準的な回転楕円体の形状を示し、システムは重力下で最も低いエネルギーを有する傾向がありました。

a 体積比率分析実験における湿潤法のスケッチ。 b A-C複合構造の光学形態。 c A-C 複合構造の蛍光形態 (Zen、Carl Zeiss、バージョン 8,0,0,273)。 d 結晶化学における六角形のクローゼットパケットの格子。 e A-C バイオインクキットの部品。 f – k ポータブル A – C バイオインクの準備手順。 b、c については、各実験を独立して 3 回繰り返し、同様の結果が得られました。

緊急用バッグは、保管と携帯性の要件を満たすように設計されました (図 2e)。 Ouyangらによって以前に記載されているように、細胞をロードするコンポーネントを凍結保存培地に浸し、凍結管に保存しました。 30. C成分も別の凍結管に保存しました。 1 つのキット内の A/C コンポーネントの体積比率は、それぞれ 74.05%/25.95% でした。両方の凍結管を液体窒素で満たされた容器内に保管した。

事故により、凍結チューブが容器から取り外され、ポータブル USB バッテリーで駆動される 37 °C の小さな加熱パッドで解凍されました (図 2f)。加温装置のない緊急性の高い事故の場合は、体温を利用して直接加温することも可能です。確かに、患者の皮膚の寒さによる損傷に注意する必要があります。次に、凍結保存培地を注射器とナプキンで除去した。コンポーネントを細いスプーンで C コンポーネントに移し、均一に撹拌した後、A-C バイオインクをコーンプリンティングノズルを備えた新しいシリンジに移し、プロの in-situ バイオプリンターまたは手作業で in-situ バイオプリンティングを行い、続いて 405 で光架橋しました。 -nm青色懐中電灯は安全性が確認されており、歯の光硬化や新生児黄疸の青色光治療など、現在の医療現場で幅広く使用されています。

実際には、バイオインクの総体積は、適用される凍結チューブの体積と量によって決まります。 A-C バイオインクの生産段階では、製造要件に応じて、準備された A-C バイオインクにさまざまなタイプの凍結チューブを装填できます。さらに、救助側では、凍結チューブの量に関して、救助者は患者の傷害の状況に応じて、A-C バイオインクを充填した凍結チューブをできるだけ多く確実に摂取できます。したがって、A-C バイオインクのさらなる開発と大量生産により、このバイオインクシステムは、可能な限り大きな組織欠損の in-situ バイオプリンティングに実現可能になるでしょう。

A-C バイオインクは、現場処理のさまざまな事故状況に適応するために、さまざまな温度条件下で高いレオロジー堅牢性を備えている必要があります。 A30/5～C30/20、A30/5～C300/20、A30/5～C30/5、CバイオインクC30/20、C300/20、C30/5を用意しました。 4、24、および 37 °C が選択されました。この温度では、GelMA 前駆体溶液はそれぞれ、押し出しバイオプリンティングに対して過剰なゲル化、最適化されたゾルゲル、および過剰なゾル化状態になります 31,32。

フロースイープの結果は、A-CバイオインクとCバイオインクの両方が、選択した3つの温度下でせん断減粘機能を有し（図3c）、押出バイオプリンティングの基本要件を満たしていることを示しました。これは、高いせん断速度で GelMA ミクロゲルが互いに分離し、それらの間の摩擦が消失したためです。さらに、C成分中の個別のGelMA分子の配向は一致する傾向があり、分子の絡み合いが減少しました（図3a）。発表された研究 9,33 によると、主にミクロゲルで構成されるシステムはビンガム流体特性を持っていました。 A ～ C バイオインクのフロースイープデータは、次のようにビンガム流体モデルにさらに適合されました。

ここで \(\sigma\)、\({\sigma }_{\rm {{y}}}\)、\({\eta }_{{\rm {B}}}\) および \(\ dot{\gamma }\) はそれぞれ応力、降伏応力、ビンガム粘度、せん断速度です。すべての A ～ C バイオインクは、ビンガム流体の特徴と、特定の応力を超える応力とせん断速度の間の線形関係を示しました（図 3d、e）。降伏応力は、GelMA分子がコラーゲン様スピロヘータ、スピロヘータ凝集体、凝集ネットワークを連続して形成するC成分の過剰なゲル化により4℃で増加しました（図3b）。降伏応力の下/上での固体/流体の特徴は、それぞれ静摩擦を超えた A コンポーネント間の内部摩擦、ミクロゲルの位置異常によるものでした。

a A-C バイオインクのずり減粘機能のメカニズム。 b GelMA 前駆体溶液のゾルゲル移動のメカニズム。 c フロースイープテスト。 d ビンガム流体モデルによるフィッティング。 e 降伏応力。 (n = 3 回の独立した実験。データは平均値 ± SD として表示されます。) f 発振周波数テスト。 g チキソトロピー試験。 h リサイクルされたフローの温度上昇試験。

バイオインクは、ノズルからフィラメントを形成し、形状を維持するために固体の特徴を示すために流動性を備えている必要があります。振動周波数テストの結果は、異なる温度下のすべてのA〜Cバイオインクが、それぞれ低/高周波数下で固体/流体の特徴を有し、ビンガム流体特性の恩恵を受けていることを示しました（図3f）。注目すべきことに、従来の単一成分の GelMA バイオインクはゾル化に移行し、体温 (37 °C) では形状を維持できません。ただし、37 °C 以下でも、A-C バイオインクは低周波下で固体状態を示し、創傷への沈着の可能性が実証されました。周期的に変化する振動振幅 (200% および 1%) を加えることによるチキソトロピーの結果は、A-C バイオインクの状態遷移が迅速かつ明白であることを示し、その速い自己修復速度を裏付けています。 (図3g)

感熱性バイオインクは、特定の温度下で安定した状態に達するまでに時間がかかります。さらに、ある温度では、ある時点でのゾルゲルの状態は前の状態の影響を受け、温度の上昇/下降の過程でまったく異なります。 A-CおよびCバイオインクの流動温度ランプテストを実行して、温度の上昇/下降を3回繰り返したとき（4～39℃、5℃/分）の粘度変化を調べました（I～III）（図3h））。結果は、同じバイオインクの温度上昇/降温プロセスの粘度曲線さえも重ね合わされていないことを示し、感熱性バイオインクの状態可逆性と安定性が低いことを証明しました。ただし、C バイオインクと比較して、A-C バイオインクの連続 3 回のテストにおける粘度曲線で囲まれたゾーンはほぼ重なっており、A-C バイオインクが以前の状態の影響を効果的に回避できることを示しています。さらに、このような広い温度変化範囲において、C バイオインクの粘度は 4 ～ 5 倍に伸びましたが、A ～ C バイオインクの粘度はミクロゲルの主な役割により 1 倍以内に維持されました。注目すべきことに、有望なバイオプリンティング温度である 20 ～ 24 °C は、粘度が劇的に変化する範囲でもありました。現場でのバイオプリンティング中にこの範囲内にあるわずかな温度が発生すると、従来のバイオインクの粘度は急激に変化し、予測不可能なリスクがもたらされることが想像できますが、A-C バイオインクは粘度の安定性を大幅に完全に維持し、保証することができます。治療の有効性。

押出および堆積状態から A ～ C バイオインクの印刷可能性を評価するために、模擬現場バイオプリンティングシーンが確立されました。押出状態は3つの環境温度(4、24、37℃)とA30/5～C300/20、C300/20を選択し、一定流量で押出しました。 (図4a)。 37 °C では、C バイオインクは過度のゾル化状態にあり、液滴を形成しました。 4 °C では、C バイオインクは過剰なゲル化状態にあり、シリンジ内でヒドロゲルのバルクとなり、断続的に断片を形成していました。 C バイオインクは 24 °C でのみ良好な印刷適性を示し、均一なフィラメントを形成しました。しかし、A-C バイオインクは、その優れたレオロジー堅牢性のおかげで、3 つの温度で均一なフィラメントを形成できます。成膜状態は、最適な押出状態が得られる環境温度を24℃に設定しました。患者の傷をシミュレートするために、受け台を 37 °C (体温) に設定し、食品着色料溶液 (血液) を塗りました (図 4b)。堆積された A-C バイオインクは 3D 構造を完全に維持できましたが、C バイオインクは徐々に溶けて「血液」と混合されました。したがって、A-C バイオインクは、創傷周囲の複雑な状態に優れた適応性を示すと考えられます。さらに、市販の 3D バイオプリンターを使用して A-C バイオインクを印刷することに成功し、大まかに制御された環境温度 (30 °C) および「傷ついた」受け基盤上で 12 層、高さ 7.5 mm の 3D 立方体を構築しました。 (図 4c、補足ノート 5、9、および補足ビデオ 3)。

a 押し出されたフィラメントは異なる温度で形状を変化します。 b 37 °C で「血液」が満たされた「傷」の形状を維持。 c 「血液」で満たされた「傷」の立方体を、37 °C で A-C バイオインクを使用して 3D プリントします。 d 安定した結合力形成のメカニズム。 e 界面の内部摩擦。 f 組織上のアミノ基と GelMA 上の光生成アルデヒド基間の水素結合。 g A-C バイオインクと豚の腱を使用した引張結合試験。 h A30/5 ～ C30/20 と豚腱の結合ストレス試験。 i A-C バイオインクと豚のリブを使用した圧縮結合テスト。 j A30/5～C300/20と豚リブの結合応力試験。

in vitro バイオプリンティングでは、3D 構造が堆積プラットフォーム上で架橋されるため、移植後の組織との強い結合力が不足します。治療中に移植された構造を移動させることは、患者にとって無効または危険となる可能性があります。対照的に、その場で堆積したA-Cバイオインクは、欠陥/ヒドロゲル界面に強い結合力を形成します（図4d）。これは、C成分が体温に触れると流動性を示し、欠陥空孔に容易に侵入し、界面の付着部位と内部摩擦が増加するためです（図4e）。さらに、GelMA の特殊な化学的特性に基づいて、A-C 複合構造は創傷に補助的な界面力を構築できます。これはおそらく光生成されたアルデヒド基が組織表面のアミノ基と結合するためであると考えられます 34（図 4f）。強い結合力を明確に観察するために、A30/5-C30/20バイオインクを新鮮な豚の腱に注ぎ（図4g）、A30/5-C300/20バイオインクを新鮮な豚の肋骨に注ぎました（図4i）。全方向の力が A ～ C 構造に追加されました (補足ビデオ 4)。 A-C 構造は組織表面に強く付着しています。 A-C バイオインクと組織表面の間の結合力を調査するために、A30/5-C30/20 および A30/5-C300/20 を (高さ約 2 mm) 流し込み、2 枚の新鮮な豚の腱 (断面図) の間に光架橋結合させました。それぞれ約3cm×1cm）と新鮮な豚バラ肉2枚（断面約⌀1.6cm）。結合応力は、2 つの組織片を反対方向に 1 mm/min でクリップすることによって、組織 - ヒドロゲル - 組織構造を引き伸ばす方法によってテストされました。 A30/5〜C30/20と豚の腱の間の結合応力は4000 Pa以上に達する可能性があり（図4h）、A30/5〜C300/20と豚の肋骨の間の結合応力はほぼ6000 Paに達する可能性があります（図4j）。 A30/5 ～ C300/20 は圧縮に適しており、引張試験中に亀裂が発生する可能性があるため、A30/5 ～ C300/20 とリブ曲線で 2 つのステップが発生しました。すべての結果は、A-C バイオインクが強い結合力の要件を満たすことを示しました。

複合構造を確立するための従来の方法、つまり強化足場を印刷してから軟質ハイドロゲルをキャスティングする方法と比較して、A-C バイオインクに基づく方法は明らかに優れています。第一に、構造設計がより柔軟になり、A コンポーネントの周囲に自発的に形成される足場ネットワークが強化されます。さらに、A/C 成分は両方とも炭素-炭素二重結合を有する GelMA であるため、光架橋中に、エレクトロスプレーでの GelMA ミクロゲル表面の未反応の炭素-炭素二重結合が切断され、C 成分の切断された二重結合と結合し、強力な炭素-炭素二重結合が形成されます。従来の方法には存在しない、A/C界面の共有結合（図5a）。

a A-C複合構造の安定な共有結合形成過程のメカニズム。 b 引張試験曲線。 c さまざまなバイオインクの引張状態。 d 圧縮試験曲線。 e さまざまなバイオインクの圧縮状態。 f 引張/圧縮 A-C 複合構造と単位セルのシミュレーションモデル。 g A-C 複合構造の圧縮シミュレーション。 h A-C 複合構造の引張シミュレーション。

A30/5 ～ C300/20、C300/20、A30/5 ～ C30/5、C30/5 の圧縮特性と、A30/5 ～ C30/20、C30/20、A30/5 ～ C30/5 の引張特性、C30/5をテストしました。圧縮弾性率はそれぞれ204.00、2608.00、16.26、および3.73 kPa（図5b）、ヤング率はそれぞれ1.81、11.98、0.80、および1.26 kPa（図5d）であり、C成分が機械的特性を明らかに強化したことを示しています。印刷された構造の変化は、目視観察によっても証明されました（図5c〜e）。

A-C複合構造内部の応力分布を有限要素シミュレーションにより解析した。構造は HCP モデルとして簡略化されました (図 5f)。引張/圧縮モデルの変位境界条件はそれぞれ50%/10%に設定されました(図5g、h)。 C構造と比較して、A-C複合構造では、内部に「印刷された」強力な足場のように、高いフォン・ミーゼス応力がミクロゲル間に分布しており、これにより、異なるA-Cで同様の機械的環境を細胞外マトリックス（ECM）に提供することが可能になりました。バイオインクの種類。結晶化学における単位胞研究手法と同様に、HCP と同じ切開法で「A-C 単位胞」という概念を革新的に設定し、両方の内部に低応力ミクロゲルを圧縮状態で詰め込んだ規則的な高応力ネットワークを表示します。 /引張モデル。

A30/5 カプセル化骨髄間質細胞 (BMSC) をエレクトロスプレーして培養し、A-C バイオインクの機能細胞治療単位としてさらに使用しました。 1日目、4日目、および7日目の細胞生存率は、LIVE/DEADキットで90％を超えていることを示し（図6a）、A30 / 5の基本的な生体適合性を示し、F-アクチンの形態はBMSCが徐々に体内に広がる可能性があることを示しました。 3D 微環境 (図 6b)。さらに、一部の A30/5 封入 BMSC を 3 日間の基本培養後、骨形成誘導培地中で培養しました。誘導の7日目に、A30/5をアルカリホスファターゼ（ALP）で染色し、誘導されたBMSCが初期骨形成段階に入ったことを示しました（図6c）。誘導の21日目に、A30 / 5をアリザリンレッドS（ARS）で染色し、誘導されたBMSCが後期骨形成段階に入り、A30 / 5の内部にカルシウム小結節を生成したことを示しました（図6d）。骨形成分化能力と潜在的な治療効果。さらに、BMSC を備えた A30/5 は、その場印刷中に印刷ノズルからせん断力を受け、細胞のアポトーシスを引き起こす可能性があります。フローサイトメトリーによるアポトーシス試験の結果（図6e）から、押出によって引き起こされるアポトーシスは明らかではなく、A30 / 5によって形成された柔らかい環境が、押出中のせん断力からカプセル化されたBMSCに抵抗し、生物学的機能を保証できることを実証しました。

a GelMA ミクロゲルにカプセル化された BMSC の生存率。 b GelMA ミクロゲルにカプセル化された BMSC のアクチン形態。 c 骨形成誘導されたBMSCを含むAコンポーネントのALP検査。 d 骨形成誘導されたBMSCを含むAコンポーネントのARS検査。 e フローサイトメトリーによるアネキシン V-FITC/PI によるアポトーシス検査。 a ～ d では、各実験を独立して 3 回繰り返し、同様の結果が得られました。

A-Cバイオインクの治療作用を調べるために、BMSCを含むまたは含まないA30/5-C300/20バイオインクをラットの頭蓋欠損（カラム：直径5 mm、高さ1.5 mm）の内側に直接堆積し、光架橋しました（図7a）。 2週目では、マイクロコンピューター断層撮影により、BMSC負荷A〜Cグループでの新しい骨形成が明らかになりました（図7c）。しかし、ブランクグループでは明らかな新骨は形成されず、BMSCを負荷していないグループでは非常に限られた量の骨再生が示されました。これはおそらく、ヒドロゲルが元の欠損位置で関連する細胞の足場として機能し、より多くの成長スペースを提供したためであると考えられます。さらに、BMSCを負荷したA〜Cグループは、より高いBV/TVでより優れた骨再生効果を示しました（図7b）。 4週目に、BMSC負荷A-C群では骨が損傷部位をほぼ完全に架橋し、BMSC負荷のないグループではさらに新しい骨組織の成長も見られました。 BV/TV 値はすべてのグループで時間とともに増加し、BMSC 負荷グループと BMSC 無負荷グループの両方がブランクグループよりも有意に高かった。 X線検査と一致して、2週間目のヘマトキシリンおよびエオシンによる組織学的分析（図7d）およびマッソントリクローム染色（図7e）により、BMSC負荷グループサンプルで最大の表面積を持つ新しい骨形成が明らかになり、顕著な骨形成は見られませんでした。空のグループと BMSC がアンロードされたグループ。 4 週間目には、すべてのグループで骨形成が増加しました。高倍率での組織学的観察により、BMSC負荷グループの典型的な構造を有する新生骨には、他のグループよりも多くの新しい成熟骨形成領域が示されていることが確認され、BMSC負荷A-Cバイオインクが臨界期における内因性骨形成を促進できることが示されました。サイズのラット頭蓋欠損モデル。

a ラット頭蓋欠損モデルにおける A-C バイオインクの移植と光架橋。 b BV/TV 値。 (n = 5 ラット。データは、GraphPad Prism 8 を使用した平均値 ± SD として表示されます。) 両側二元配置分散分析とそれに続く Tukey 事後多重比較検定を使用しました。また、統計検定はそれぞれ 2 週群または 4 週群内で実施されましたが、2 週群と 4 週群間では行われませんでした。 c マイクロコンピュータ断層撮影検査。 d H&E 染色による組織学的分析。 e マッソントリクローム染色による組織学的分析。 d、e については、各実験を独立して 3 回繰り返し、同様の結果が得られました。

臓器欠損の実際の臨床例は、火災、交通事故、軍傷などあらゆる種類の事故によって引き起こされます。したがって、臓器欠損の 3D 形態とサイズは大きく異なります。臨床環境における A-C バイオインクの in situ バイオプリンティング能力を調べるために、ほぼ長方形、正方形、台形、三角形 (高さ 1.5 mm) の頭蓋欠損を持つ 4 匹のラットの「患者」を歯科用トレフィンを使用して作成しました (図 1)。 8a–c)。ロボットアームシステムは、その場バイオプリンティングツールとして選択されました（図8b）。 4匹のラットの「患者」が手術台に置かれた。欠陥の 3D モデルはコンピュータ支援設計ソフトウェアで再構築され、印刷ルーチンプログラムはスライシングソフトウェアで生成され、ロボットアームの制御システムにロードされました。 A30/5 – C300/20 バイオインクでカプセル化された BMSC は、4 人の「患者」の頭蓋欠損にその場で堆積され、405 nm の青色光で光架橋されました (補足ビデオ 5)。移植の6週間後、マイクロコンピューター断層撮影により、すべての「患者」で欠損の端から中心に向かって新しい骨が形成されていることが明らかになり（図8d、e）、これにより、A-Cバイオインクの高い実現可能性が検証されました。 -現場バイオプリンティング療法。

ラット頭蓋欠損モデルの 3D 構造形態。 b A-C バイオインクを使用したその場バイオプリンティングステップ。 c 元の「患者」の頭蓋欠損の形態。 d 6週間のその場治療後のマイクロコンピュータ断層撮影検査。 e 6週間の現場処理後のBV/TV値。

マイクロゲルベースのバイオインクに関する現在の研究のほとんどは、集めたマイクロゲルを in vitro/vivo で堆積させて 3D 構造を形成するだけであり、患者の日常活動によって皮下組織が崩壊したり創傷部位から押し出される可能性があります。その間、マイクロゲルベースのバイオインクの優れた機能と革命は、in-situ バイオプリンティングでは無視されてきました。ここで提案されたバイオコンクリートバイオインクには、オンデマンドセメント成分、つまりバイオインクシステム内の異なるヒドロゲル前駆体溶液が含まれており、骨材とセメント成分の間の相互作用により、臨床現場での開発において制限されていた問題をうまく解決しました。バイオプリンティング。マイクロゲルの有望なレオロジー特性と GelMA の機械的調整機能を組み合わせることで、A-C バイオインクは、優れたその場印刷堅牢性、複合構造確立の容易さ、生体内治療作用、組織/ヒドロゲル界面への結合力、および携帯性を示しました。

これまでに、機能性微小組織の作製方法がますます提案されている。さらに、細胞を含む A コンポーネントは、特定の誘導培地で簡単に事前誘導でき、携帯性と治療効果を高めるために液体窒素で保存できるため、臨床要件を満たす A-C バイオインクの大量生産と輸送を実現できます。。私たちは、A-C バイオインクが臓器欠損の治療において重要な役割を果たし、臨床現場でのバイオプリンティング技術の開発を大きく推進すると信じています。

将来的には、A-C バイオインクはさらに多くの方法で設計できるようになります。 A コンポーネントの場合、A コンポーネント内のセル種を変更して、より多くの機能を実現できます (補足 7)。さらに、我々の以前の研究では階層的ミクロゲルが作製されており、それにより相乗的な治療作用を実現することができた。 C コンポーネントについては、GelMA がここで適用される唯一の生体材料であり、機械的調整性の高いヒアルロン酸メタクリロイル (HAMA) などの他の生体材料が代替品となる可能性があります 36、37、38、39、40。さらに、探索の過程で、内皮細胞をカプセル化するA成分が、血管内皮増殖因子（VEGF）を分泌する腫瘍細胞をカプセル化するC成分によって血管新生される可能性があることを発見しました41,42（補足注8）。これにより、臓器欠損上のin situ血管新生が実現される可能性があります。さらに、大規模なヒドロゲル構造における栄養/ガス供給の問題は、その場バイオプリンティングまたはインビトロバイオプリンティングのいずれにおいても共通の問題である。幸いなことに、私たちの研究室43または他の研究室44の研究者は、この問題を解決するための一連の効果的な方法を提案しました。したがって、将来的には、次世代 A-C バイオインクは、A-C 構造内により多くの栄養ネットワークを形成するために、成分または相分離成分を犠牲にしたものとして設計される可能性があります。

携帯性とマルチシーンの実現可能性を考慮して、将来的には、A-Cバイオインクその場バイオプリンティング用のインテリジェントで持ち運び可能な機器の開発を求めます。仮定として、複合ボトル一体型加熱装置、携帯用バッテリー、懐中電灯を設計することができる。さらに、都市開発の観点から、ガソリンスタンドのような「窒素ステーション」やシェア自転車のような「シェアードハンドヘルド現場バイオプリンタ」を社会サービスとして公共の場所に設置することができ、A-Cバイオインクの長期保管が可能になります。長距離の移動とその場でのバイオプリンティングの即時性が保証されます。

純粋な 5% (w/v) GelMA プレポリマー溶液は、凍結乾燥した GelMA (EFL-GM-30、純度 > 99.9%) とフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム (LAP、0.5% (w/v)) を溶解することによって調製しました。 /v)、純度 > 99.8%)、リン酸緩衝食塩水 (PBS) 中で。溶液を０．２２μｍフィルターを通して濾過した。金属ノズル（３０Ｇ）と金属リングにより電場を形成した。エレクトロスプレーインクの流量は５０μＬ／分に設定され、注入ポンプによって駆動された。電圧は２．８６ｋＶに設定した。エレクトロスプレーインクの適切な流動性を確保するために、環境温度は 30 °C に設定されました。エレクトロスプレーされた微小液滴は、シリコンオイルで満たされたペトリ皿で受け取られ、405 nm の青色光で架橋されました。架橋ＧｅｌＭＡミクロゲルを遠心管に移し、１２８．５７×ｇで５分間（３回）遠心分離して、シリコンオイルを除去した。ミクロゲルはＰＢＳ中に保存した。 BMSC を含む GelMA ミクロゲルの場合、BMSC をエレクトロスプレーインクに 5 × 105 細胞/ml の細胞密度で混合しました。調製したBMSC含有GelMAミクロゲルを、10％（v/v）ウシ胎児血清（FBS）を添加したDMEM/F-12完全培地中で37℃、5％CO2で培養した。

純粋な GelMA プレポリマー溶液は、凍結乾燥した GelMA (EFL-GM-30/EFL-GM-300、純度 > 99.9%) とフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム (LAP、0.5% (w/ v)) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中で。溶液を０．２２μｍフィルターを通して濾過した。

A-C バイオインクのレオロジー試験では、25 mm の平行板ローターが選択され、試験スペースは 2.5 mm (A コンポーネントの直径の約 5 倍) に設定されました。 Cバイオインクのレオロジー試験では、4℃の試験では25mmの平行板ローターと1mmの試験スペースを設定し、24℃と37℃の試験では50mmの平行板ローターと0.5mmの試験スペースを設定しました。 C テスト。フロースイープ試験の場合、せん断速度範囲は 0.1 ～ 100 s-1 に設定されました。ビンガム流体モデルとのデータフィッティングは MATLAB を使用して実行されました。発振周波数テストの場合、振幅は 1% に設定され、周波数範囲は 1000 ～ 0.1 rad/s に設定されました。チキソトロピー試験の場合、周期的に変化する振動振幅 (200% および 1%) がサンプルに追加されました。交替周期は 30 秒とし、各段階 5 点を 3 回繰り返した。流動温度上昇テストでは、バイオインクは 3 回冷却/加熱を繰り返しました。温度変化速度は５℃／分とした。

圧縮サンプルでは、A30/5 ～ C300/20、C300/20、A30/5 ～ C30/5、および C30/5 バイオインクを円筒型 (φ9 mm × 6.3 mm) に注入し、405 nm ブルーで架橋しました。ライト。引張サンプルでは、A30/5 ～ C30/20、C30/20、A30/5 ～ C30/5、および C30/5 バイオインクを直方体の型 (20 mm × 3 mm × 5 mm) に注入しました。機械的試験はヒドロゲルサンプル試験機で実施されました。運動速度は 1 mm/min に設定しました。機械シミュレーションは COMSOL Multiphysics を使用して実行されました。 C30/20 構造と C30/5 構造のポアソン比は、それぞれ 0.034 と 0.031 に設定されました。引張シミュレーションにおける変位境界条件は、モデルの元の長さの 50% に設定されました。 C300/20 構造と C30/5 構造のポアソン比は、それぞれ 0.218 と 0.031 に設定されました。圧縮シミュレーションにおける変位境界条件は、モデルの元の長さの 10% として設定されました。

BMSC (ラット由来の初代細胞) は、浙江大学医学部口腔病学病院、浙江省口腔疾患臨床研究センター、浙江省口腔生物医学研究重点研究所、浙江大学癌センター、杭州 310006 から提供されました。エレクトロスプレーされたBMSCを含むGelMAミクロゲルをDMEM/F-12完全培地中で培養した。 BMSC 生存率を 1、4、および 7 日後に測定しました。細胞生存率は、Live/Dead アッセイで 40 分間テストされました。その後、CLSM を適用して、各フレームの 2 つの画像 (生細胞の場合は緑、死細胞の場合は赤) を取得することにより、カプセル化された BMSC を画像化しました。生細胞数と死細胞数を ImageJ で分析し、BMSC 生存率を細胞総数に対する生細胞数の比率として計算しました。カプセル化されたBMSCの形態については、TRICファロイジン(40734ES75、Yeasen Biotechnology)で染色されるアクチンを含む細胞骨格色素で染色し、核をDAPIで染色した。 BMSC を含む A コンポーネントを CLSM で画像化しました。

エレクトロスプレーされた BMSC を含む GelMA ミクロゲルを DMEM/F-12 完全培地で 3 日間培養しました。その後、デキサメタゾン（０．１ｍＭ）、β－グリセロールリン酸二ナトリウム塩水和物（１０ｍＭ）、および１－アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）を用いてＤＭＥＭ／Ｆ－１２骨形成誘導培地を調製した。 BMSCを含むGelMAミクロゲルを、調製した誘導培地を用いて誘導した。 7日目に、BMSCを含むA成分を4%(w/v)ポリホルムアルデヒドで30分間固定し、アルカリホスファターゼ(ALP)で染色した。 21日目に、BMSCを含むA成分を4%(w/v)ポリホルムアルデヒドで30分間固定し、アリザリンレッドSで染色した。染色サンプルを光学顕微鏡で観察した。

BMSCを含むA30/5を上記のようにエレクトロスプレーし、その半分を20Gの円錐形ノズルから150μL/分で押し出した。 4 時間の培養後、BMSC を含む押し出された A30/5 と押し出されていない A30/5 を 20 U/mL コラゲナーゼ II PBS 溶液で 30 分間 (37 °C) 分解して、GelMA ハイドロゲルを除去しました。採取した細胞をアネキシン V-FITC/PI キットで染色し、フローサイトメトリーでそれぞれ検査しました。データは FlowJo ソフトウェアで分析されました。

30 匹の 12 週齢雄 SD ラット (250 ～ 300 g) が浙江大学動物実験センター (中国杭州) から提供されました。実験は浙江大学動物研究倫理委員会によって承認され（倫理承認番号：ZJU20210172）、浙江大学の施設内動物管理使用委員会に従って実施されました。 SD ラットを、ブランク、ブランクコンクリート、および誘導コンクリートヒドロゲルミクロスフェアを含むグループにランダムに割り当て、ヒドロゲルミクロスフェアの移植による頭蓋欠損における骨形成の可能性を評価しました。 SDラットを2%ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射により麻酔した。完全に毛を剃り、消毒した後、手術領域の中央を縦方向に切開し、軟組織を慎重に分離して頭蓋冠を露出させました。骨膜を剥ぎ取り、歯科用トレフィンを使用して直径 5 mm の両側欠損を 2 つ作成しました。次いで、ヒドロゲル微小球を欠陥に移植した。ペニシリンは術後 3 日間 1 日 1 回注射されました。

移植の 2 週間および 4 週間後、ラット (各グループ n = 5) を CO2 窒息によって安楽死させ、さらなる特性評価のために頭蓋冠標本を採取して 4% (w/v) パラホルムアルデヒドで固定しました。頭蓋欠損領域内の再生骨組織の三次元 (3D) 構造は、次のスキャンパラメーターを使用してマイクロ CT (SkyScan、SkyScan 1176、ベルギー) で評価されました: 解像度 18 μm、電圧 65 kV、電流385μA、0.5mmのA1フィルター。 3D 再構成はシステムソフトウェア (SkyScan、ベルギー) を使用して実行されました。骨体積と組織体積の比 (BV/TV) は、直径 5 mm の円柱 ROI を使用して定量的に決定されました。

移植の 2 週間および 4 週間後、採取した標本を 4% (w/v) パラホルムアルデヒドで 48 時間固定し、15% エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 溶液で室温で 2 週間脱灰しました。 EDTA 溶液は 3 日ごとに交換されました。次に、サンプルを段階的アルコールシリーズを通じて脱水し、パラフィンに包埋しました。包埋標本の中心から厚さ約 5 μm の組織切片を採取し、ヘマトキシリン・エオシン (H&E) 染色またはマッソントリクローム染色を行って骨形成を評価しました。画像は明視野顕微鏡（オリンパス、東京、日本）の下で得られた。

歯科用トレフィン (直径 5 mm、高さ 1.5) を使用して、さまざまな頭蓋欠損形態を作成しました。「患者」I、II、IIIの欠損形態は、それぞれ長方形、正方形、台形で、円が2つ、4つ、5つあり、中心間距離は1mmでした。「患者」IV の欠損形態は 3 つの円を含む三角形で、中心間距離は 4 mm でした。欠陥モデルは Solidworks で再構築され、Repetier ソフトウェアでスライスされて経路情報が取得され、ロボットアームシステムの制御ソフトウェアを使用する対応する制御プログラムに転送されました。バイオインク流量は150μL/min、ノズル移動速度は120mm/minとした。印刷ノズルとしては 20G の円錐形ノズルを選択しました。ノズルの X-Y 原点は頭蓋欠損の右後端に基づいて設定され、Z 原点は欠損周囲の頭蓋骨の最高点に基づいて設定されました。注入ポンプはロボットアームシステムの端に固定されていました。 A-C バイオインク印刷後、堆積したバイオインクを 405 nm の青色光で 30 秒間架橋し、頭皮を縫合して滅菌しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

著者らは、この研究の結果を裏付けるすべてのデータは、論文およびその補足情報内で、または要求に応じて対応する著者から入手できることを宣言します。

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この研究は、中国国家重点研究開発プログラム（2018YFA0703000、YH）、中国国家自然科学財団（番号U1909218、YH）、中国国家自然科学財団創造研究グループ科学基金の資金提供を受けて行われました。 (番号 T2121004、YH)。

これらの著者は同様に貢献しました: Mingjun Xie、Yang Shi。

浙江大学機械工学部、流体動力およびメカトロニクスシステムの国家重点実験室、310027、杭州、中国

Mingjun Xie、Jingbo Zhang、Zichen Chen、Jianzhong Fu、Yong He

浙江省機械工学部 3D プリンティングプロセスと装置の主要実験室、浙江大学機械工学部、310027、杭州、中国

Mingjun Xie、Jingbo Zhang、Zichen Chen、Jianzhong Fu、Yong He

浙江大学医学部口腔病学病院、310006、杭州、中国

Yang Shi、Chun Zhang、Mingjie Ge、Zhijian Xie

浙江省口腔疾患臨床研究センター、310006、杭州、中国

Yang Shi、Chun Zhang、Mingjie Ge、Zhijian Xie

浙江省口腔生物医学研究重点研究所、310006、杭州、中国

Yang Shi、Chun Zhang、Mingjie Ge、Zhijian Xie

浙江大学がんセンター、310058、杭州、浙江省、中国

ヨン・ヘ

鄭州大学、材料加工および金型の主要実験室、450002、鄭州、中国

ヨン・ヘ

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MX はすべての作製と体外実験を実行し、著者全員からの意見をもとに論文を執筆しました。 YS は動物実験と特性評価を実施しました。 CZ と MG は、動物実験と特性評価の実施を支援しました。 JZ は、その場バイオプリンティングパスプログラムの設計とロボットアームの操作を支援しました。 JF、ZC、ZX は研究デザインに貢献しました。 YH はプロジェクトを企画し、プロジェクトの提案を行いました。

ヨンヘさんへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた福田淳二氏と他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Xie, M.、Shi, Y.、Zhang, C. 他。バイオコンクリートバイオインクを使用したその場 3D バイオプリンティング。 Nat Commun 13、3597 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-30997-y

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受信日: 2021 年 11 月 9 日

受理日: 2022 年 5 月 20 日

公開日: 2022 年 6 月 23 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30997-y

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