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Dec 04, 2023

ジェオスミンはミツバチの防御行動を抑制し、異常な神経反応を誘発します

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 3851 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

ジェオスミンは、湿った土壌中の細菌によって生成される臭気物質です。 一部の昆虫と非常に関連性が高いことがわかっていますが、その理由はまだ完全には理解されていません。 今回我々は、ミツバチに対するゲオスミンの効果に関する最初の試験を報告する。 刺す試験では、ミツバチの警報フェロモン成分である酢酸イソアミル（IAA）によって誘発される防御行動が、ゲオスミンによって強く抑制されることが示された。 しかし、驚くべきことに、この抑制はゲオスミン濃度が非常に低い場合にのみ存在し、濃度が高くなると消失します。 われわれは、電気アンテナグラフィーによって嗅覚受容体ニューロンのレベルでの根底にあるメカニズムを調査し、ゲオスミンとIAAの混合物に対する反応が純粋なIAAよりも低いことを発見し、嗅覚受容体レベルでの両化合物の相互作用が示唆された。 触角葉（AL）のカルシウムイメージングにより、ゲオスミンに対する神経反応が濃度の増加とともに減少し、観察された行動とよく相関していることが明らかになりました。 ALにおける匂い伝達とコーディングの計算モデリングは、側方抑制と組み合わせたゲオスミンによる嗅覚受容体タイプの広範な活性化が、観察されたゲオスミンに対する非単調増加-減少反応を引き起こし、したがって匂いに対する行動反応の特異性の根底にある可能性を示唆している。ジェオスミン濃度が低い。

ジェオスミンは、シアノバクテリア、放線菌（ストレプトミセス属など）、原生動物、カビ、真菌など、さまざまなクレードの複数の微生物によって生成されるかび臭い土のような香りの化合物です1、2。 放線菌（ストレプトミセス属を含む）は膜翅目の巣と広く関係しており、自然に抗生物質を生成するため膜翅目の巣を病原体から守っていると考えられます3、4、5。 最近の研究では、ヒアリの女王 (Solenopsis invicta) が放線菌が豊富な土壌に優先的に新しい巣を作ることがわかりました。 この誘引はゲオスミンによって部分的に媒介され、女王の生存率が高くなりました6。 ゲオスミンは、ビネガーバエのキイロショウジョウバエやネッタイシマカなどの他の昆虫にとっても生態学的に重要です。 しかし、それらの種では劇的に異なる反応を引き起こします。 ジェオスミンは、魅力的な化合物の存在下であっても、キイロショウジョウバエに強い嫌悪感を引き起こします7,8。 これは、カビの生えた不適切な果実での産卵を避けるため、または落ちた熟した果実とのコントラストを良くして、探索をより効率的にするためである可能性があります9。 エーでは。 逆に、ネッタイシマカは、ゲオスミンが強力な誘引物質です10。 これは、卵が産まれる可能性のある湿った土壌の存在を示しているためと考えられます。 実際、ゲオスミンはペトリコールの主要成分の 1 つである「湿った土の香り」としても知られています2。

昆虫の最初の嗅覚処理脳中枢である触角葉 (AL) では、ほとんどの匂いが糸球体反応の組み合わせパターンを誘発します 11,12。 しかし、多くの場合、生物学的関連性が高い一部の匂い (性フェロモンなど) は、単一の糸球体のみを活性化します。 この反応が高次脳中枢でも独立して処理され、常同的な行動反応が生じる場合、その回路は標識線と呼ばれます12。 ジェオスミンは、D. melanogaster および Ae の単一の糸球体のみを活性化する非常に数少ない化合物の 1 つです。 ネッタイシマカ8,10。 ハエでは、その処理はさらに機能的に高次脳中枢に分離されており、そこで他の嗅覚信号よりも優先されて回避行動が引き起こされます8。

多くの昆虫種におけるゲオスミンの生態学的関連性にもかかわらず、ミツバチ Apis mellifera におけるこの臭気に対する行動的および生理学的反応はこれまで研究されていませんでした。 ここでは、この疑問に取り組むための最初のデータを提供します。 この研究は、人間にとって夏の雨が差し迫っていることを嗅覚的に知らせるゲオスミンが、ミツバチにとっての気象指標にもなり得るかどうかという疑問によって動機付けられました13。 もしそうであれば、ミツバチの行動を調整するはずです。これは、巣内の活動についても、広範囲にわたるミツバチの行動に対する天候依存の影響が報告されているからです14。 採集者の行動の変化は、天候の変化を予測しているようにさえ見えます15。

防御行動への影響の可能性についてはほとんど研究されていません。 高温多湿の条件下では刺痛が増加するという証拠がいくつかありますが 16,17 、毒虫学者の報告は必ずしもこれらの観察を裏付けるものではありません。 私たちは、この文脈で防御行動に対するゲオスミンの影響を調査することにしました。

ミツバチは潜在的な侵入者を刺すことでコロニーを守りますが、この行動は他のコロニーのメンバーが放出する警報フェロモンの存在下で刺激されます18。 私たちは、十分に確立された刺傷アッセイを使用して、実験室でこの挙動をテストしました19。 さらに、我々は、アンテナ電図法により嗅覚受容体ニューロンのレベルで、またゲオスミン誘発活性の生体内二光子カルシウムイメージング20により触角葉投射ニューロンのレベルでの行動に関するニューロンの相関関係を検索した。 最後に、スパイク ニューラル ネットワーク モデルを使用して、観察された部分的に異常なニューロン反応がミツバチの嗅覚系の現在の理解にどのように関連しているかを調査しました。

競技場内に提示された黒い回転ダミー人形に対する一組のミツバチの刺傷行動が、さまざまな臭気刺激にさらされた状態で監視されました。 対照群では、ミツバチを純粋な鉱油にさらしました。 このグループでは、試験の15％で、2匹のミツバチのうち少なくとも1匹がダミーに対して刺す行動を示しました（図1a、補足ムービー1）。 ミツバチが競技場内でゲオスミンに曝露された場合、刺咬行動の頻度に対する影響は観察されませんでした。 代わりに、ミツバチの警報フェロモンの活性化合物である酢酸イソアミル (IAA、濃度 10-1) にミツバチを曝露すると、刺す行動は 50% の刺傷に大幅に増加しました (t(47) = 3.3、p = 0.002) ) 予想どおりです (図 1b)。

低濃度のゲオスミンは、IAA による刺傷行動への動員を防ぎます。 (a) 行動アッセイの概略図。 ミツバチの二匹組には回転するダミー人形が与えられ、刺すか刺さないかを選択できるようになった。 赤い矢印は、臭気をアリーナに運ぶ気流の入口点を示しています。 (b) 少なくとも 1 匹のミツバチが刺傷行動を示した試験の頻度 (n = 1 グループあたり 48 匹のミツバチ)。 MO: ミネラルオイル (溶剤コントロール); Geo 10−x: 濃度 10−x のジェオスミン。 IAA 10–1: 濃度 10–1 の酢酸イソアミル。 同じ文字でラベル付けされたグループは、互いに有意な差はありません (GLM、FDR 手順による多重比較のために補正)。

ミツバチを IAA と低濃度のジェオスミンの混合物 (10-6) に曝露した場合、両方の刺激間の相互作用の明確な兆候が 25% の刺傷確率で観察され、以前と比較してこの行動の頻度が大幅に減少しました。 IAA のみに曝露されたミツバチ (t(47) = 2.4、p = 0.02)。 鉱物油コントロールに関しては、もはや有意差はありませんでした (t(47) = 1.1、p = 0.27、図 1b)。

しかし、混合物中のジェオスミン濃度が 10-3 の場合、40% の症例で刺傷が観察され、IAA のみで刺激されたミツバチの行動と大きな違いはありませんでした (t(47) = 0.6, p = 0.57)。 実際、この刺傷頻度も対照ミツバチよりも有意に高く（t(47) = 2.9、p = 0.006）、この場合の行動はIAAに対する反応によって引き起こされたことを示唆しています（図1b）。

私たちは、触角の嗅覚受容体ニューロン (ORN) を標的として、嗅覚系の末梢におけるゲオスミンと IAA の組み合わせの行動効果のニューロン相関関係の探索を開始しました。 電子アンテナグラフィーは、臭気への曝露に応じたアンテナの両端の電極間の電圧変化を測定します。 この信号は局所電場電位記録であり、その振幅はすべての ORN で引き起こされる活動の合計に比例します。 私たちの実験では、ミツバチの触角 (n = 24) を、10-6 から 10-3 まで対数的に変化する 4 つの濃度のジェオスミン、2 つの濃度の IAA (10-3 と 10-1)、および両方の臭気の混合物に曝露しました。これらすべての濃度で。 さまざまな刺激に応答して 1 匹のミツバチから得られる信号の例を図 2a に示します。 ただし、これらの信号の大きさは、動物の年齢と状態、電極の導電性、特定の ORN に近接した電極の配置、地面の配置、その他の要因など、多くの要因によって影響されます。 反応の大きさの個体間差を制御するために、各ミツバチの反応はまず IAA 単独の各濃度 (0、10–3、10–1) に対して正規化され、次にすべてのミツバチの平均が計算されました。そして統計分析は、EAG 応答の繰り返し測定に対して行われました (フリードマン検定とそれに続くダンの多重比較)。 正規化された平均間の統計的な違いを強調するために、補足図 1 に各ミツバチの生データをさらに示します。

嗅覚受容体ニューロンの反応。 ( a) 1 匹のミツバチからすべての匂いと組み合わせに対する EAG 応答曲線の例。 記録の下の黒い線は、刺激の存在 (2 秒) を示します。 (b) ジェオスミンのさまざまな濃度に対する正規化された応答振幅の平均 (± SEM)。 （c）IAA 10-3と組み合わせたさまざまな濃度のジェオスミンに対する正規化された応答振幅の平均（±SEM）。 （ d ）IAA 10–1と組み合わせたさまざまな濃度のジェオスミンに対する正規化された応答振幅の平均（±SEM）。 IAA 10-x: 酢酸イソアミル 10-x (体積/体積); Geo 10-x: Geosmin 10-x (vol/vol); 統計は、フリードマン検定に続いて、対照、IAA3、およびIAA1とのダン多重比較(それぞれB、C、D)からのものです: ****p < 0.0001; ***p < 0.001; **p < 0.01; *p < 0.05。 テストしたすべてのミツバチ（n = 24）からの個々の振幅応答を補足図1に示します。

結果は、ジェオスミン濃度が 10-4 以上の場合、鉱油対照とは大きく異なる応答を示しました。 シグナルは、濃度の増加に応じて典型的な指数関数的な振幅増加を示しました（図2b、補足図1d）。 最低濃度のジェオスミン (10-5 および 10-6) に対する応答は、コントロールと有意な差はありませんでした。これはおそらく、シグナルの差がこの方法の分解能限界を下回っていたためと考えられます。 しかし、ゲオスミンの濃度が10〜5の場合、ほとんどの場合、振幅が増加する明らかな傾向が観察できます（図2a、b、補足図1a、d）。

10-3の濃度のIAAによる刺激は強い反応を誘発しましたが（図2a）、その効果は顕著ではありませんが、ジェオスミン10-6の存在下では減少するように見えました（図2c、補足図1b、e）。 。 ジェオスミンの濃度が 10-4 以上の場合、混合物に応答するシグナルは、IAA のみの刺激と比較して大幅に増加しました（図 2c、補足図 1b、e）。 アンテナを濃度 10-1 の IAA との混合物に曝露した場合、ジェオスミン濃度 10-5 が存在するとシグナルの減少が見られ、この場合、違いは IAA に関して有意でした (p = 0.01、図2d、補足図1c、f)。 この違いは、個々の応答が示されている補足図 1c でよりよく理解できます。 ここで、ミツバチの 75% (24 匹中 18 匹) は、濃度 10-1 の純粋な IAA と比較して、濃度 10-5 のジェオスミンの存在下では反応が低下しています (個体は青い線で示されています)。

結果は、行動的にテストされたIAA濃度（10-1）では、混合物に対する応答振幅が個々の化合物に対する応答の合計よりも低いことを示しました（補足図1fの緑色の破線）。 ジェオスミン濃度が 10-5 の場合、純粋な IAA と比較した場合、この抑制が応答の大幅な低下に反映されていることがわかります。 ただし、行動的にテストされたゲオスミンの濃度では、差は有意ではありませんでした。 これは、部分的には、この方法によって課せられた検出可能性の閾値によるものである可能性がある。すなわち、最低濃度でのゲオスミン単独による刺激は、検出可能な応答信号を引き起こさなかった（図２ｂ）。また、同様に、ＩＡＡ１０−１と組み合わせた場合にも同様である。 （行動試験濃度）、ゲオスミン 10-6 には有意な効果はありませんでした（図 2d）。 さらに、EAG 中の 10-5 濃度のジェオスミンの観察された効果は、行動反応における 10-6 ジェオスミン濃度で観察された効果と一致しており、ORN の反応と行動レベルで観察された現象との相関関係の可能性を示唆しています。 しかし、行動への影響がすでに受容体レベルで引き起こされている場合、この相互作用は触角葉までのシグナル伝達の後に現れるはずです。

次の処理レベル全体にわたって臭気によって誘発される活動を追跡するために、ミツバチの触角葉の投射ニューロンのカルシウム イメージングを実行しました。 これらのニューロンは、AL から高次の脳中枢に情報を伝えます。 画像化実験は、行動アッセイと同じ濃度で同じ匂いに曝露された 14 匹のミツバチに対して行われました。 臭気刺激によって誘発された蛍光の変化は、19個の糸球体で記録されました（補足図2）。 3秒の刺激期間にわたって平均すると、これらの糸球体シグナルはミツバチ全体で非常に定型的な反応パターンを示しました（図3cは例としてIAAジェオスミン混合物を示しています）。

糸球体反応。 (a) 2 つの異なる濃度 (10-6 および 10-3) の純粋なジェオスミン、および 3 つの花の匂い化合物に対する平均糸球体応答曲線。 19 個の糸球体に対する濃度 5∙10–3 の 1-ノナノール、アセトフェノン、および 3-ヘキサノール (補足図 2a) は、14 匹のミツバチのすべての特定された糸球体の平均です。 臭気刺激は 3 秒後に始まり、白い破線で示された 3 秒間続きました。 色分けされているのは、カルシウムによって誘発される蛍光の変化 (パーセント) です。 ジェオスミン 10-6 と 10-3 に対する反応の差は、糸球体 19 (t(2) = -12.1、p = 0.013) と糸球体 36 (t(13) = -2.2、p = 0.047) で有意でした (b) 10-1濃度の警報フェロモン化合物酢酸イソアミル（IAA）、およびIAAと2つの濃度のジェオスミンの混合物に対する平均糸球体反応曲線。 10-1 IAA に対する反応が強いため、カラー スケールが異なります。 純粋な IAA に対する反応と IAA + ジェオスミン 10-6 に対する反応の違いは、糸球体 49 (t(13) = -2.6、p = 0.043) と糸球体 52 (t(6) = -3.3、p = 0.02) で顕著であり、糸球体 43 の IAA および IAA + ジェオスミン 10–3 (t(6) = -3.3、p = 0.02)、糸球体 52 の IAA + ジェオスミン 10–6 と IAA + ジェオスミン 10–3 (t(6) = 3.2) 、p = 0.028)。 （ c ）各ミツバチのIAAと10-6ジェオスミンの混合物に対する時間平均糸球体反応振幅。反応の常同性を示しています。 灰色は糸球体が明確に識別されなかったケースを表します。

平均時間応答曲線は、4 つの純粋な匂いに対する大きく異なる反応を示しています (図 3a): 行動試験で使用したのと同じ 2 つの濃度のジェオスミン (鉱物油中の 10-6 および 10-3)、および 3 つの花の匂い 1 -ノナノール、アセトフェノン、および 3-ヘキサノールはすべて鉱物油中で 5∙10–3 の濃度です。 濃度 10 ～ 6 のジェオスミンはさまざまな糸球体で反応を誘発し、そのスペクトルは花の香りのスペクトルよりも広いことが判明しました。 それは、3 つの糸球体 (19、28、36) で持続性興奮性反応、他の 4 つ (25、29、35、49) で一過性興奮性反応、および少なくとも 3 つの糸球体 (42、48、60) で抑制を示します。匂いは、最大 4 つの糸球体でのみ同等の反応を引き起こします。 驚くべきことに、ゲオスミンに対する応答は、1000 倍高い 10-3 濃度ではほぼ完全に消失し、投射ニューロン (PN) 応答パターンが非単調な濃度依存性であることを示唆しています。 ジェオスミン 10-6 と 10-3 の違いは、糸球体 19 (t(2) = − 12.1、p = 0.013) と糸球体 36 (t(13) = − 2.2、p = 0.047) で顕著です。 平均値は糸球体 28 にも違いがあることを示唆していますが、被験者間の変動が大きいため、効果は有意ではありません (t(13) = − 1.5、p = 0.17)。

次に、ミツバチは、行動実験と同じ濃度の 10-1 の警報フェロモン化合物 IAA で再び刺激されました。これは他の刺激よりも少なくとも 20 倍高く、したがってはるかに強い反応を引き起こします。 IAA に加えて、IAA とジェオスミンの混合物もテストされました。 注目すべきことに、IAAに反応するすべての糸球体は、ゲオスミンにも反応しているようです。 また、混合物では、ジェオスミンの寄与は 10-6 の濃度ではっきりと見えますが、10-3 の濃度ではほぼ完全に消えます。 純粋な IAA と IAA + ジェオスミン 10-6 の違いは、糸球体 49 (t(13) = -2.6、p = 0.043) と糸球体 52 (t(6) = − 3.3、p = 0.02) で顕著です。 平均値は糸球体 19 にも違いがあることを示唆していますが、糸球体が明確に識別されるのは 3 匹のミツバチのみであるため (図 3c)、その効果は有意ではありません (t(2) = − 2.5、p = 0.14)。 これらの違いは、IAA + ジェオスミン 10–3 の混合物では消えます。 この混合物に対する反応は、糸球体 43 の純粋な IAA に対する反応とは大きく異なります (t(6) = − 3.3、p = 0.02)。 IAA + ジェオスミン 10-6 と IAA + ジェオスミン 10-3 に対する反応は、糸球体 52 では大きく異なります (t(6) = 3.2、p = 0.028)。

ジェオスミンと IAA の間の有意な相互作用は検出できず、混合物に対する応答は単一化合物の応答の正確な合計であると考えられます。 したがって、触角レベルまたは AL における 2 つの臭気間の相互作用を直接確認することはできませんでした。 しかし、光学的にアクセスできる糸球体は全体の 12% のみであるため、そのような相互作用を除外することもできませんでした。 測定された PN 信号のみを考慮すると、これまでの証拠は、IAA とジェオスミンの間の相互作用がキノコ体 (MB) や側角 (LH) などの高次脳中枢でのみ発生していることを示しています。

時間の関数としての PN の応答は複雑かつ非単調であり、濃度の関数としての個々の PN の応答は上昇することもあれば下降することもある 22 ことはよく知られていますが、すべてのジェオスミンに対する一過性の応答は異常であるように思われます。観察された糸球体は、高濃度では減少するように見え、10-3 の濃度では事実上消失します。 私たちは、この観察と他の観察がシステムに関する現在の理解と一致するかどうかを調査するために、ミツバチの初期の嗅覚システムの計算スパイキング ニューラル ネットワーク モデルを構築しました。 このモデルは以前の研究 23,24 に基づいて構築されており、嗅覚受容体を 2 段階の結合および活性化プロセスで記述しています 25。 次に、嗅覚受容体は嗅覚受容体ニューロン (ORN) を興奮させ、さらに嗅覚受容体ニューロン (ORN) が触角葉の投射ニューロン (PN) と局所ニューロン (LN) を興奮させます。 同じ受容体タイプを持つすべての ORN は同じ糸球体に投射します 26。 LN は、他のすべての糸球体の PN および LN を阻害します。 回路を図 4a に示します。 このモデルには 160 の受容体タイプ、つまり糸球体があり、糸球体ごとに 5 つの PN と 25 の LN があり、現在の最良の推定値を反映しています。 各タイプの 60 個の ORN をシミュレートしました。これは、シミュレートされた各 ORN が実際には約 10 個の ORN を表すことを意味します。 詳細は「方法」に記載されています。 図 4c は、シミュレーションからのデータ トレースの例を示しています。 臭気は、ゼロから一定濃度まで 3 秒間の段階的変化 (灰色のバー) として導入され、その後 0 に戻りました。 OR の活性化は臭気の発生と同時に開始され、その後 ORN のスパイクにつながり、その後、PN およびLNスパイク。 ORN と LN の例ではスパイク レートの適応のヒントを得ることができますが、これはスパイク レートが高くなるほど顕著になります。 このモデルでは、PN にはスパイク レートの適応がありません。

計算モデル。 (a) モデルの回路図。 ORN は、受容体の種類 (色) に応じて、AL 内の PN と LN を励起します。 LN は同じ糸球体内の PN から励起も受け取ります。 LN は他のすべての糸球体で PN および LN を阻害しますが、それ自身の糸球体では阻害しません。 (b) 「IAA」と「ジェオスミン」の臭気の異なる混合物に対する ORN の反応。 (c) 典型的な臭気反応のデータ例。 上部パネルのバーは、臭気への曝露を示します。 ORN、PN、および LN については、最も強く応答する糸球体に接続された 1 つの任意のニューロンの例のトレースが表示されます。 明確にするために、LIF 膜電位トレースに垂直線としてスパイクを追加しました。 （ d ）それぞれ3秒間、異なる濃度で提示された100の異なる模擬臭気に対する、最も応答性の高い糸球体におけるPN（スパイク密度関数SDF）の時間平均応答。 （ e ）「ジェオスミン」、「IAA」、および2つの臭気の混合物に応答した各糸球体の平均PN活性を示すヒートマップ。

EAG記録とPNイメージングの結果を検査することにより、高濃度のジェオスミンに対する観察されたすべての糸球体における異常な反応の低下は、ALのLNによって媒介される局所的な阻害によるものである可能性があるという仮説を立てました。 さらに、非単調な挙動は広く報告されていないため、ジェオスミンは過剰な阻害を受けやすくする特別な特性を持っているに違いないと推論しました。 私たちは、感度 (OR モデルの η)、受容体タイプ間の応答の幅 (OR モデルの σ)、および活性化 (OR モデルの k2) などの匂い反応の特性を調査しました。 応答の幅が、PN における非単調な応答と濃度の関係をもたらす決定的な要因であることがわかりました。 図 4d はこの結果を示しています。 応答特性がランダムに分布する 98 個の臭気と、より特異的な 2 個の臭気を生成しました。1 つは非常に幅広い応答プロファイルを持ち、Geosmin で識別されました。もう 1 つは、平均的な幅のプロファイルを持つが、非常に高い活性化が識別されました。 IAAと一緒に。 図4dからわかるように、「ゲオスミン」は濃度の関数として非単調な応答を示しますが、「IAA」は本質的に単調です。 他の臭気のランダムサンプルは、その挙動が異なりますが、大部分は典型的な増加するシグモイド応答曲線を持っています。 臭気反応の単調性（正式な定義については「方法」を参照）またはその欠如が、臭気プロファイルの幅と強く相関していることがわかりました（補足図3、4、5、6）。 異常に幅広い反応を示す臭気に対する非単調な挙動の背後にある直観は、濃度が増加するとより多くの OR タイプが活性化され、関与する糸球体の数が増加し、したがって OR の活性化の増加による抑制の増加に加えて、全体的な抑制が増加するというものです。すでにアクティブになっているタイプ。 同時に、各糸球体への興奮は、対応する OR タイプのシグモイド応答曲線に従ってのみ増加します。 応答プロファイルが広い場合、抑制の増加の組み合わせが興奮の増加を上回る可能性があり、全体的な PN 応答が減少します。 応答プロファイルが狭い場合、新たに動員された OR タイプによる過剰な阻害は少なくなり、PN 応答は増加し続けます。

次に、EAG データで観察されたゲオスミンと IAA の相互作用も再現できるかどうかを調べました (図 2)。 ここでは、すべての OR タイプにわたる ORN スパイクの総数を EAG 測定の賢明な代用として解釈し、相互作用は受容体でのシントピック混合効果による可能性が高いと推論しました。 これを念頭に置くと、ジェオスミンの活性化が IAA よりも低い場合、Geosmin はアンテナ上の IAA 応答の阻害につながる可能性があります。 そこで、「Geosmin」の活性化率 k2 を「IAA」よりも低く設定し、「Geosmin」と「IAA」の混合物に対する ORN スパイク数を生成しました。 手動による探索を通じて、およそ 1:3 の関係 (k2Geo = 0.03 kHz、k2IAA = 0.1 kHz) の場合、応答は実験観察との共通性を示す抑制効果を示したことがわかりました (図 2b-d、4b)。 異なる濃度比での正確な定量的関係は、k2 比に加えて、「ジェオスミン」と「IAA」の OR 活性化プロファイルの重複にも依存します。 私たちは、最大値間の特定の距離を持つガウス応答プロファイルとして「Geosmin」と「IAA」を生成することで、これをテストしました。 距離が小さい（オーバーラップが大きい）場合、IAA応答のシントピック抑制が支配的であり、距離が大きい（オーバーラップが小さい）場合、応答はより相加的になります（補足図7）。 モデルは原理的にはゲオスミンによるIAA応答の抑制を再現しますが、このスキームでは、モデルの動作と実験のレベルでの一致を失うことなく、図2dに見られる多かれ少なかれ一定の応答を完全に再現することはできませんでした。 AL (上記を参照)。 ただし、重複する応答プロファイルを生成する他の方法、または実際にはガウス応答プロファイル以外の方法を使用すると、実験観察をより厳密に再現できる可能性があります。

最後に、PN の非単調な挙動と EAG の副加法的応答特性を再現するために生成された「ジェオスミン」および「IAA」臭気が、PN 活動のカルシウム イメージング データと同様の PN 応答を生成するかどうかを尋ねました。 AL。 図4eは、10–6、10–3のジェオスミン（図3aと比較）、10–1のIAA、および10–1のIAAと10–6のジェオスミンの混合物に応答するPNのシミュレートされた応答パターンを示しています。および 10–3 (図 3b と比較)。 全体として、反応は実験データと同様に見え、「ジェオスミン」10-6 に対する中程度の反応があり、10-3 で本質的に消失します。 混合物では、IAA 10-1 に「ゲオスミン」10-6 を追加しても目に見える効果はほとんどありませんが、「ゲオスミン」10-3 を追加すると応答プロファイルが若干鋭くなるようです。「IAA」と「ゲオスミン」によって強く活性化された糸球体がさらに活性化された糸球体や弱く活性化された糸球体はわずかに抑制されますが、これはおそらく LN による全体的な阻害が加えられたためと考えられます。 目視検査によると、同様の効果が実験データに存在するように見えますが (図 3b)、統計的に有意な効果は確認されませんでした。

ミツバチにとってコロニーを守ることは非常に重要ですが、非常に費用もかかります。 トゲのある針は弾性素材に埋め込まれたままで、ミツバチが離れると腹部から引き裂かれます。 したがって、労働力の不必要な損失を避けるために、警報フェロモンに反応して刺すかどうかの決定は厳しく規制されるべきである。 これが実際に当てはまることを示すいくつかの証拠があります。警報フェロモンの濃度が高すぎる場合 27、グループのサイズが増加する場合 28、および食欲をそそる化合物の存在下では、警報フェロモンの反応性が低下します 19。 これらの追加の合図は、脅威がすでに対処されている、またはこれが防御反応にとって適切な状況ではないことをミツバチに示す可能性があります。 今回我々は、ジェオスミンの存在によって引き起こされる警報フェロモン反応の抑制のさらに別の例を報告します（図1）。 興味深いことに、我々は 2 種類の濃度のゲオスミンを使用してミツバチをテストしたところ、最も低い濃度のゲオスミンを使用した場合にのみこの阻害効果が認められました。 行動に対する匂いの濃度依存性の影響はこれまでに報告されており、例えばハサミアリは、自身の警報フェロモンの成分である1-ヘキサノールを放出する源に近づくと（したがって濃度の上昇を感知すると）、一連の行動を示す29。 最近、IAA 自体に対する非単調な行動反応がミツバチで報告されています 27。 より正確には、同じ行動アッセイで試験した個々のミツバチの刺傷頻度は、IAA 濃度が 2.5∙10-1 までは増加しましたが、より高い濃度を使用すると低下しました。 ジェオスミンと IAA によって活性化される糸球体の間に観察される強い重複に加えて、1 つの仮説は、ジェオスミンによる相加的な活性化により、行動反応がこの IAA 用量反応曲線の減少範囲にシフトするのではないかというものである可能性があります。 この仮説はさらに検証する必要がありますが、刺傷行動の減少は非常に高いIAA濃度でのみ現れ、おそらくここで記録したものよりもはるかに強力な活性化を必要とするため、その可能性は低いことがわかりました。

別の匂いの追加によって警報フェロモンに対する刺すような反応が低下するという、同様の防御行動の調節が以前に観察された 19。 この効果は、食欲をそそる価値のある花の化合物に特有のものでした。 ゲオスミンはミツバチに餌の信号を送っているのでしょうか？ この仮説は、将来の研究でこの化合物に反応した口吻の自発的伸長の頻度を測定することによって検証される可能性があります 19。 Streptomyces 細菌は花で発見されており、ミツバチを病原体から守ることができます 30。 Streptomyces 種の大部分はゲオスミンを生成できますが 31、花の花束内で実際にゲオスミンが検出されたことは、少数のサボテン種でのみ報告されています 32。 したがって、この化合物がミツバチを花に引き寄せ、相互作用の仲介に直接関与できるかどうかはまだ検証されていない。 もう一つの興味深い可能性は、ゲオスミンが花に特異的に存在するわけではないが、花蜜の利用可能性の一般的な増加を知らせる信号であるということである。実際、雨の後に花蜜の生産量が増加するが、このとき、ゲオスミンは土壌バクテリアによっても放出される。 したがって、ゲオスミンの存在は、ちょうど食欲をそそる花の化合物と同じように、ミツバチの採餌反応を引き起こす可能性があります。

ジェオスミンは、ハエ 7、8、蚊 5、トビムシ 34 を含む多くの節足動物種において誘引または反発を引き起こす生態学的に関連した化合物です。 ミツバチの場合、その生態学的機能は依然として謎に包まれていますが、私たちのデータは、それがこの重要な花粉媒介者にも同様に関連している可能性があり、さらに調査する価値があることを示唆しています。

電気アンテナグラフィーの結果は、純粋な匂いによる刺激に対してEAG振幅が典型的な増加する用量反応曲線を示すことから、行動の非単調な濃度依存性はゲオスミンに対する受容体の異常な感受性に起因しないことを示唆しています（図2b）。 ただし、行動効果はジェオスミンと IAA の混合物に対してのみ観察されたため、最も興味深いのは、これら 2 つの刺激間の潜在的な相互作用です。 実際、純粋な臭気応答振幅の予想される線形和と比較すると、二成分混合物に対する応答振幅は、濃度に応じてこの明らかな増加を示しません。 低 IAA 濃度のジェオスミンの混合物は、ジェオスミン濃度の増加に伴ってシグナル増加が減少する傾向を示します (図 2c)。 IAA 濃度が高い場合 (図 2d)、その効果は顕著になります。ジェオスミン 10-5 の添加によりシグナルが大幅に減少し、予想される大幅な増加はジェオスミン濃度が 10-3 になるまで観察されません。 濃度が高くても必ずしも応答振幅の増加が生じるわけではない用量反応曲線は、ミツバチの EAG 測定で以前に観察されており、これらは臭気混合物に対する反応でもありました 36。

ジェオスミンと IAA の相互作用は行動シグナルと一致しており、IAA 誘発刺痛に対するジェオスミンの効果は、ジェオスミン 10-6 では顕著でしたが、ジェオスミン 10-3 では消失しました。

この相互作用の根底にあるメカニズムは、受容体レベルでのゲオスミンによる IAA のマスキングである可能性があり、その効果が報告されています 37。 興味深いことに、この研究では、強力なマスキング剤として特定されたのは IAA でしたが、いくつかの臭気によってマスキング可能であることも示されました 37。 マスキングの要件の 1 つは、両方の臭気に対する受容体の感度です。 EAG シグナルは 60,000 個の ORN の大部分におけるアクティビティの合計であるため、ごく一部の ORN に限定されたマスキング メカニズムを明確に識別することはできません。 潜在的な相互作用についてさらに洞察を得るために、触角葉のレベルで臭気反応のカルシウムイメージングを実行しました。

両方の臭気間の相互作用の 1 つの要件は、糸球体投射ニューロンの応答マップによって確認されました。 さまざまな被験者で一貫して特定できたのは、160 個の糸球体のうち 19 個のサブセット (補足図 1) だけでしたが、IAA によって活性化されたすべての糸球体は、ジェオスミン 10-6 によっても活性化されることがわかりました (図 3)。

カルシウムイメージングのさらに驚くべき発見は、ジェオスミン濃度に対する投射ニューロン応答の非単調依存性でした（図3a、b）。 行動研究と同じ濃度を使用すると、ゲオスミン 10-6 に対する広範囲で強い反応は、10-3 ではほぼ完全に消失しました。 これも行動データと一致しています。 ただし、このような非単調な濃度依存性は非常にまれであると思われます。 触角葉のレベルでは、これまでミツバチでは報告されていませんでした。 蛾の研究では、AL の電気生理学的記録からフェロモン成分に対するそのような反応が示されていますが、ニューロンの種類はまだ不明のままです 38。 ミツバチキノコの体入力レベルでは、PN ブートンは非常に多様な濃度依存性 39、単調増加および単調減少、および非単調変化を示しました。 著者らは、ボタンのレベルでの阻害を示唆した。 蛾に関する別の研究では、PN樹状突起のALレベルでは単調増加のみが見出されたが、PN体細胞レベルでは非単調応答も見出された40。 示唆された根本的なメカニズムはシナプス後抑制でした。 阻害によって濃度依存性にそのような変化が生じる可能性があるこれら 2 つの位置に加えて、今回のデータは、触角葉内の阻害も影響を及ぼしている可能性があることを示唆しています。

IAA とジェオスミンの混合物に対する応答の画像化により、この条件下でもジェオスミン濃度に対する非単調な依存性が確認されました。 ただし、IAAとジェオスミンの相互作用は画像化された糸球体のサブセットでは観察されず、混合物は両方の化合物の純粋な臭気応答の正確な合計と思われる応答を誘発しました（図3b）。 これは、2 つの考えられるシナリオを示唆しています。相互作用は糸球体全体で異なり、画像化できたサブセットには表示されない、または EAG 信号の観察は ORN の相互作用によるものではなく、相互作用は ORN のレベルで発生しないかのいずれかです。匂いが識別される触角葉ではなく、匂いの価数が抽出されるキノコ体や側角などの高次脳中枢にあります41。

カルシウムイメージングの最後の重要な結果は、ゲオスミンが誘発する広範な応答マップの観察です。これは、応答が単一の糸球体に限定されていたショウジョウバエ 8 や蚊 10 の結果とは対照的に、この臭気の組み合わせコーディングを証明しています。ラベル付き行の相補的コーディング機構42。 実際、嗅覚受容体の進化に関する研究では、種間でコード化様式に違いがある可能性が高いことが示唆されています43。 ゲオスミンが活性化した受容体のスペクトルの幅は、比較して画像化された花の匂いのスペクトルよりも実際に広いように見えます（図3a）。 この観察は、触角葉ネットワークにおける通常の入力信号の処理から反転濃度依存がどのように生じるかを調査する次の試みにとって重要であることが判明した。

触角葉出力ニューロンにおけるゲオスミン応答の逆濃度依存性の不可解な結果、および嗅覚受容体ニューロンレベルでのジェオスミンとIAAの間の相互作用は、嗅覚受容体の計算モデルの助けを借りて文脈化された。ニューロンとAL。 我々は、このような応答パターンが、受容体応答の特定の特性と、AL における興奮性と抑制性の共役の特定のバランスの結果として発生し得ることを実証しました。 より高いジェオスミン濃度でのいくつかの弱い一過性反応の持続は、興奮性ドライブの消失ではなく抑制がシグナル変化の原因であることを示唆しています。 これは、局所介在ニューロンからの PN の抑制が感覚ニューロンからの直接興奮よりも常にわずかに遅れて到達するため、弱い位相反応が高濃度で残るというモデルによって再現されます。 濃度が高くなるとジェオスミン応答がほぼ消失することは、一見すると驚くかもしれません。同時に、他の臭気物質は完全に正常な応答プロファイルを持ち、濃度の増加に応じて応答が増加または飽和し、抑制結合のパターンはもちろん回路特性であり、回路特性とは独立しています。臭い。 私たちの計算モデルを使用して、直感的な予想に反して、同じ抑制回路が、異なる臭気物質に応答するORNのアンサンブルの幅、感度、活性化に基づいて、質的に異なる応答行動を引き起こす可能性があることを示しました。 補足図に示すように。 図3、4、5に示されているように、受容体リザーバー全体にわたる活性化の幅に応じて、濃度の増加に応じたPN応答プロファイルは単調増加から増加-減少に反転し、極端な場合には消失する可能性があります。 この結果と、観察されたゲオスミン反応の異常な濃度調整は、他の昆虫とは対照的に、ミツバチのゲオスミン反応が他の臭気に比べて実際に幅広いことを示唆しています。

文献によると、匂いの相互作用は嗅覚系のさまざまなレベルで起こることが示唆されています。 受容体レベルでは、臭気物質は抑制反応を引き起こす可能性があります。 興奮性成分と混合すると、後者の抑制が観察されています37。 これは、ORN 応答の振幅だけでなく応答ダイナミクスも変化させ、臭気強度の知覚だけでなく、臭気の同一性の知覚にも影響を与える可能性があります 44。 これらの効果は個々の受容体に特有であり、我々の実験で観察されたように、混合物に対するニューロン反応の合計が、個々の成分に対する反応の合計と比較してわずかに減少することとしてEAGシグナルに現れると考えられます。

投射ニューロンレベルでは、混合物抑制の効果が一般的に観察されます。つまり、混合物に対する糸球体の反応は、その最も強い成分に対する反応よりも低い45。 ミツバチでは、2 つの異なる AL 経路が混合臭気に対して異なる反応を示すことが判明しました。 内側路投射ニューロン（m-PN）は最も効果的な化合物によって支配されていましたが、我々の実験で画像化された外側路投射ニューロン（l-PN）は、混合物に対して抑制された反応を示すことがよくありました46。 この相互作用における局所抑制性介在ニューロンの役割は、GABAA 様受容体のアンタゴニストであるピクロトキシンの投与によってショウジョウバエで実証され、PN レベルでの混合抑制が解除されました 47。 計算モデリングにより、ある臭気反応が別の臭気反応に影を落としたりブロックしたりするのは、ミツバチ AL48 の側方抑制が原因である可能性が高いことが確認されました。 また、シミュレーションでは、混合物によりより速く、より信頼性の高い嗅覚コーディングが可能になることが示唆されており、これが動物が化学シグナル伝達において混合物をよく使用する理由の 1 つである可能性があります 24。

蛾でも相補的な効果が観察されました。 生物活性混合物は、単一成分の影響を受けない追加の糸球体を強力に活性化しました49。 この相乗効果が受容体のレベルで起こるか、ALネットワークのレベルで起こるかは未解決の問題のままである。

他の研究では、AL における混合物関連情報の処理が糸球体全体で均一ではないことが示されており、これは PN データの証拠の欠如の可能性を説明する可能性があり、混合物に関する情報の最終的な統合が可能である可能性を示唆しています。高次の脳中枢で起こります50。

混合物の相互作用における匂い価の役割がショウジョウバエで研究されました。 反対の価数を持つ匂いの混合物は、誘引物質反応性糸球体において強い阻害を引き起こした。 サイレンシングと光遺伝学的活性化による単一 ORN の操作により、誘引物質応答回路と忌避物質応答回路間の糸球体特異的なクロストークが明らかになりました。 この選択的な側方抑制は、矛盾する感覚情報の処理において重要であることが判明した 51。

総合すると、これらの研究は、私たちがデータから得ているものと同様の図を描いています。つまり、匂い混合物内の相互作用には特定の相互作用点はなく、さまざまな処理段階に沿って生成、増幅、解読される効果であるということです。昆虫の嗅覚系において。

行動実験では、IAA によって引き起こされる刺痛行動がジェオスミンによって大幅に軽減されるが、10-6 という低濃度でのみ、10-3 の増加濃度では効果が完全に消失することが示されました。 触角レベルでの両方の臭気の相互作用のテストでは、互換性のある結果が示されています。純粋な IAA と比較して、IAA + Geo 10-5 に対する全体的な応答信号が大幅に減少していることがわかりますが、ジェオスミン濃度が増加すると効果は消失します。 。 行動効果と PN 応答は、アンテナが測定可能な EAG を示さなかった 10 ～ 6 のジェオスミン濃度ですでに検出されているという事実は、実験全体で濃度を比較することがいかに難しいかを示しています 52。 アンテナに到達するジェオスミンの量はあらゆる装置の検出限界をはるかに下回っているため、濃度は臭気源の希釈という観点からのみ測定できます。 in vivo イメージングと EAG 測定の実験設定における臭気の分布は大きく異なるため、比較可能なシナリオは同じ希釈ではなく、同様の効果量によって示されます。 10-6 ゲオスミンの濃度では閾値を超える EAG シグナルは誘発されませんが、カルシウムのイメージングと挙動において明確な反応が誘発され、EAG の「有効」濃度が低いことが示唆されます。

カルシウムイメージング実験により、触角葉出力ニューロンのレベルでのジェオスミン、IAA、および混合物の臭気応答が明らかになりました。 ここでの最も驚くべき結果は、ゲオスミン自体も、濃度が増加すると画像化された糸球体における反応の減少を示すことである。これは、行動反応の減少の観察を裏付けるものであるが、観察された範囲にわたって濃度とともにORN反応が増加するというEAGの結果とは矛盾しているようである。濃度の。 しかし、コンピューターモデルは説明を提供します。つまり、ゲオスミンに対するORN応答の単調増加にも関わらず、カルシウムイメージングで観察されるように、ALの側方阻害によりPNシグナルが大幅に減少する可能性があるということです。

ただし、矛盾が 1 つ残っています。触角葉のレベルでは、ジェオスミンと IAA の間の相互作用は観察されず、混合信号はほぼ正確に両方の成分の信号の合計です。 このような相互作用の存在は、EAG と行動実験の両方によって示唆されています。 しかし、私たちの画像技術により、ミツバチの触角葉に存在する約 160 個の糸球体のうち 19 個の明確に識別可能な糸球体を記録することができたため、私たちの PN 活動マップは触角葉のレベルでのそのような相互作用の存在も除外しません。 これら 19 個の糸球体のうち、IAA に強く反応したのは 2 個だけでした。 したがって、光学イメージングが利用できない糸球体に相互作用が存在する可能性はありそうにありません。 しかし、相互作用の直接的な証拠はないため、相互作用が起こる可能性のある別のレベル、つまりより高いレベルの脳中枢が残っています。 現在まで、ミツバチキノコ本体 53 と側角 54 の反応パターンの画像化は非常に困難であることが判明しており、匂い混合物のコード化についてはこれまで研究されていませんでした。 しかし、汎神経カルシウムセンサーを発現するトランスジェニックミツバチ系統の最近の開発により、将来的には嗅覚系全体の並行イメージングさえも可能になり、すべての処理段階での混合物の相互作用が可能になるという期待が高まっている。 ショウジョウバエの画像研究は、脳のこれらの部分で匂い価価のコーディング55,56や食べ物の匂いからのフェロモンの分離57が観察されていることから、警報フェロモンによって引き起こされる行動の調節がそこで起こっている可能性が高いことを示唆している。

カルシウムイメージング実験のさらなる結果は、ハエや蚊とは対照的に、ミツバチではゲオスミンが標識線によってコードされていないが、その応答スペクトルは逆に、試験した花およびフェロモン化合物の応答スペクトルよりもさらに大きいように見えるということでした。 計算モデルは、ゲオスミン応答の非単調な濃度依存性とその幅広い応答スペクトルが、実際に側方阻害による非単調な応答振幅に関連している可能性があることを示しました。 実際、このモデルは、ジェオスミンが添加されると、受容体における匂いの同所性相互作用により、アンテナ内の IAA 信号が減少する構成例も提供します。 これは、低ジェオスミン濃度で最も強い抑制が観察された、挙動と EAG からの詳細な結果を完全には再現していません。 IAA とジェオスミンの混合物に対する受容体リザーバーの全体的な反応は、匂いとその濃度依存性の両方に対するすべての受容体タイプの親和性の詳細に依存します。これには、同所性相互作用だけでなく、濃度の増加に伴うより多くの受容体とより多くの受容体タイプの動員も含まれます。これは、観察された違いを十分に説明している可能性があります。

これらの結果は、ミツバチの防御行動の嗅覚調節を行動レベルと神経レベルの両方で理解するための新たな一歩となります。 これは、刺傷につながる神経回路の基本的な理解に加えて、養蜂にも実際に役立つ可能性があります。

最近の研究では、D. suzukii などの害虫に対する天然の忌避剤としてゲオスミンの使用が提案されています58。 ミツバチなどの非標的昆虫に対するジェオスミンの影響については、この目的でジェオスミンを商業化する前にさらに調査する必要があります。

フェロモン反応には状況が重要であるため、ジェオスミンの効果を完全に理解するには実地実験が必要です。 これには、特に巣の入り口での行動の監視、ミツバチの年齢、コロニー内での役割、飛び出すか戻るかを制御することが含まれます。

誘発されたニューロン活動を側角やキノコ体などの高次の嗅覚処理中枢に追跡することも、ゲオスミン、IAA、およびさまざまな濃度でのその混合物の価数を研究するための将来の貴重な方向性となるでしょう。 これを追加のモデリングで補完して、基礎となる回路とプロセスの理解をより適切に裏付け、その理解に疑問を投げかけるテスト可能な仮説を生成することもできます。

総合すると、私たちのデータとモデルは、ジェオスミンが異常な神経反応特性に基づいてミツバチの防御行動を強力に調節するという最初の証拠を提供します。 したがって、ミツバチの生態学的関連性が考えられます。 この関連性の性質は、純粋に推測の域を出ません。 人間にとって、ゲオスミンは天気の指標として機能します。 ゲオスミンの匂いがしばしば雨の前に発生するメカニズムが最近明らかになりました 13 。雨滴が地面に当たると、エアロゾルが生成され、塵や臭気物質、さらにはジェオスミンを生成するバクテリア自体を運び、時には数キロメートルにわたって運ばれます。 ミツバチもこの情報を悪用するかどうかという問題は追跡調査されるべきである。 ジェオスミンの役割と、差し迫った雨の通知に関与している可能性を理解することは、ミツバチの気候変動への適応における問題を予測し、生態学的および経済的被害を防ぐのにも役立つ可能性があります。

ミツバチの採餌者は、2019年9月から2019年11月と2020年7月から2020年8月にかけて、イタリアのロヴェレートにあるセイヨウミツバチのさまざまなコロニーから収集されました。コロニーは実験期間全体を通じて自由に採餌し、定期的な養蜂検査を受けていました。 異なるコロニーからの同数のミツバチが行動実験に参加しました。 ミツバチは晴れの日と曇りの日（雨の日は除く）に2回（午前10時30分頃または午後14時頃）に分けて捕獲されました。

採餌動物は巣箱から出るときにプラスチック容器を使用して収集され、研究室内に戻されてアイスボックスに置かれました。 ミツバチが動かなくなったら、注射器に改造した 50 ml の遠心分離管に 2 匹ずつ入れました。 ミツバチが完全に回復した後、スクロース溶液（50% スクロース水、体積/体積）の 2 滴をチューブに入れた。 すべてのミツバチは、刺傷行動を調査するセットアップでテストされる前に、少なくとも 15 分間 (最後のミツバチでは最大 1 時間まで) 回復することができました。 1匹または両方のミツバチがセットアップに置かれたときに回復不良の兆候（逆さまに保持するのが困難、見当識障害、および/または無気力な歩行）を示した場合、試験全体はさらなる分析から除外されました。 ミツバチを収容するために使用したすべての材料は、次回使用する前に洗浄し、80% エタノールで洗浄しました。

合計 288 匹のミツバチが行動実験に参加し、6 つの臭気条件に均等に配分されました (したがって、サンプル サイズは 1 グループあたり 48 匹になります)。 このサンプルサイズは、以前の研究に基づいて選択されました19,59。

すべての臭気は Sigma-Aldrich から入手し (純度 98 ～ 99.9%)、4 °C で保存しました。 それらは実験期間の開始時に鉱油で希釈され、行動実験の全期間中保持されました。 使用しないときは、これらの臭気を密封して室温で保管しました。 刺傷警報フェロモンの主成分である酢酸イソアミル（IAA）は、以前の研究と同様に 10–1 (vol/vol) に希釈されました 19,59。 ゲオスミンには 10-3 および 10-6 の濃度が選択されました。これは、これらがショウジョウバエ 8 および蚊 10 の行動反応を誘発することが示されているためです。

臭気は、10μlの臭気物質溶液に浸した濾紙を空気流に置き、3つの等間隔のチャネルを介して水平に試験領域に注入することにより、室温（24℃）で送達されました（図1a）。 臭気は、上蓋にある等間隔の 40 個の穴を介してアリーナから除去されました。 試験期間全体 (3 分間) の間、流れは継続しました。 2 つの臭気間の相互作用をテストするために、それぞれの臭気の 1 つを担持する 2 枚の濾紙を空気流の中に置きました。 流入する臭気の流れは、光イオン化検出器 (200B miniPID、aurora Scientific) によって制御されます。 ただし、これにより、最も高い臭気濃度のみを解決することができ、実験セッション間の条件の再現性が保証されます。 アリーナでは、内部の空気の乱流により、空間と時間の濃度変動が避けられません。

ミツバチの刺傷反応性は、19 に詳細に記載されているアッセイを使用してテストされました。 簡単に説明すると、ミツバチの二組が円筒形の試験場に導入され、そこで黒い羽で延長された黒い回転ダミー人形と対峙しました（図1a、補足ムービー1）。 黒い羽根の主な機能は、蜂の巣の側面をブラッシングすることで、痛みを引き起こすことなくミツバチの邪魔をすることです。 ミツバチはダミーとフェザーの両方を簡単に避けることができることに注意してください。 試験は 3 分間続き、この間に少なくとも 1 匹のミツバチがダミー人形を刺そうとした場合に「刺した」と記録されました。 この行動は、ミツバチが特徴的な刺す姿勢で腹部の先端をダミー人形または羽に押し付けながら、少なくとも 3 秒間ダミー人形または羽につかまり続けることとして定義されました。 すべての行動試験は、アリーナの上に設置された Web カメラ (Microsoft Life カメラ) で記録されました。

2 つの同一のアリーナと 2 つのダミーが使用されました。 それらの使用は、行動の潜在的な違いに寄与しないように、さまざまな臭気条件にわたってバランスが保たれていました。 各試行の前に、アリーナと羽毛のあるダミーを 80% エタノール溶液を使用して洗浄しました。

一般化線形モデル (glm) を使用して、スティンギング試験の割合を分析しました。 臭気グループは固定因子として設定され、ハイブとダミーはランダム因子として定義されました。 タイプ I エラーを制御するために、ペアごとの比較 (R の glht パッケージ) が実行され、続いて Benjamini と Hochberg の誤検出率 (FDR) 補正が行われました。

EAG技術は60から適応され、記録は標準的なEAG装置(Syntech、Hilversum)を使用して行われた。 ミツバチの採餌者は収集され、行動アッセイと同じ方法で扱われました。 氷上で冷やした後、各動物の 1 本の触角を花茎の高さで切り取りました。 側方化効果を避けるために、この実験では左右両側から合計 n = 24 個のアンテナ (左側 14 個と右側 10 個のアンテナ) が使用されました 20。 次に、各アンテナの基部を、次の成分からなるカイスリング生理食塩水 61 で満たされたガラス参照電極に挿入しました。 CaCl2 (0.21 g/l); KCl (0.35 g/l); NaHCO3 (0.2 g/l)。 記録電極を、遠位先端が切り取られた鞭毛の最後の部分と接触させた。 臭気刺激によって引き起こされた記録された電圧降下は、すべての活性化された嗅覚受容体ニューロンの脱分極を合計し、活性化されたニューロンの数とその活動の振幅に依存します。

ミツバチの触角に匂いを届けるために、特注の嗅覚計が使用されました。 臭気刺激は、鉱物油に溶解した 1 mL の臭気を含むガラスバイアルから発生します。 嗅覚計はLabViewを使用して操作し、単一チャネルはPCIe-6321多機能ボード（National Instruments）によって制御されるソレノイドバルブ（LHDA0531115、The Lee Company）によって切り替えました。 記録中の空気の流れは、実験のすべての段階で一定に維持されます (詳細については 62 を参照)。

濃度 10-6、10-5、10-4、10-3 vol/vol のジェオスミン (Geo)、濃度 10-3、10-1 vol/vol の酢酸イソアミル (IAA)、または純粋な鉱油（対照）を調製した。 オルファクトメーターのガラスバイアルにこれらの溶液を充填しました。 各ミツバチの刺激プロトコルは、各匂いと濃度の昇順で匂いの組み合わせを提示することで構成され、15 種類の刺激が生じました。図 2b ～ d を参照: コントロール、Geo 10 ～ 6、Geo 10 ～ 5、Geo 10 ～ 4、ジオ 10–3、IAA 10–3、IAA 10–3 + ジオ 10–6、IAA 10–3 + ジオ 10–5、IAA 10–3 + ジオ 10–4、IAA 10–3 + ジオ 10– 3、IAA 10–1、IAA 10–1 + ジオ 10–6、IAA 10–1 + ジオ 10–5、IAA 10–1 + ジオ 10–4、IAA 10–1 + ジオ 10–3。 刺激持続時間は 2 秒、刺激間隔は 20 秒でした。 さらに、各サイクルを 10 回繰り返したので、合計 150 の刺激が各ミツバチの触角に提示され、合計 55 分の記録が得られました。 アンテナに到達する臭気の流れは、光イオン化検出器 (200B miniPID、aurora Scientific) によって監視されます。 ただし、これにより解決できるのは 10-5 を超える臭気濃度のみであり、単一の実験セッション間および EAG とカルシウム イメージング間の再現性を確保するのに役立ちます。これは、これらの実験の場合にのみ、実験領域を通る均一な流れを保証できるためです。

応答振幅は、刺激開始後の 1 秒にわたる平均電圧から、各刺激前の 1 秒にわたる平均電圧を減算することによって計算されました。 その後、これらの値は各刺激の 10 回の繰り返しにわたって平均されました。 応答は、反復測定 ANOVA とそれに続くボンフェローニ事後検定によって分析されました。

正規化は、IAA の各濃度 (0、10-3、および 10-1) に対して、それぞれの濃度と組み合わせたゲオスミンの各濃度で得られた応答を、ゲオスミンなしの刺激に対する応答で割ることによって行われました。 コントロール (MO) の場合、正規化前にすべての値に 1 が追加され、正規化係数に 0 と 1 の間の値が含まれないようになりました。 正規化後、統計的比較のためにノンパラメトリック検定 (フリードマン検定とそれに続くダンの多重比較) が実行されました。

ミツバチは、十分に確立されたプロトコールに従って、生体内カルシウムイメージング実験のために準備されました62。 使用した採餌器を収集し、4 °C の冷蔵庫で 5 ～ 6 分間固定しました。 次に、固定化されたミツバチを、軟質歯科用ワックス (Deiberit 502、Siladent) を使用して特注のイメージング ステージ上に固定しました。 固定されたミツバチの頭のクチクラに小さな長方形の窓が切り込まれました。 腺と気管を脇に移動し、蒸留水に溶解したカルシウム感受性蛍光色素 (Thermo-Fischer Scientific) である fura2-デキストランを、マイクロチップを使用して α 葉の直下のアンテナ大脳路に注入しました 63。 注入後、n-エイコサンを用いてクチクラを元の状態に固定しました。 カルシウム色素がAL内に確実に拡散するように、ハチを暗くて涼しく湿気の多い場所に約20時間保管した。

画像化セッションの直前に、クチクラ窓、気管、腺が完全に除去されました。 シリコーン接着剤 (Kwik-Sil) を使用してミツバチの頭の上の開いた窓を覆い、数分間乾燥させました。 次に、触角葉の蛍光シグナルを二光子顕微鏡で画像化しました。

2 光子顕微鏡 (Ultima IV、Bruker) は、超短パルス レーザー (Mai Tai、Deep See HP、Spectra-Physics) に基づいています。 レーザーは、fura2 励起用に 780 nm に調整されました。 すべての画像は水浸対物レンズ (10 \(\times\)、NA 0.3、Olympus) を使用して取得されました。 蛍光をエピ配置で収集し、ダイクロイックミラーで選択し、中心が525nmで帯域幅が70nmのバンドパスフィルター(Chroma Technology Corp)で濾過した。 最後に光電子増倍管（浜松ホトニクス）で検出した。 ミツバチの寿命を縮める光損傷の影響に対して信号対雑音比 (SNR) のバランスをとるために、約 10 mW のレーザー出力が使用されました。

280 × 280 µm2 の視野は 128 × 128 ピクセルで解決されました。 蛍光強度は 13 ビットの深さで記録されました。 10.1 Hz のフレーム レートでの画像取得は刺激プロトコルと同期しました。

機能画像に加えて、糸球体の形態学的識別を行うために、触角葉の Z スタックが空間解像度 512 × 512 ピクセルおよび Z 層距離 2 μm で取得されました。

二光子顕微鏡下で匂いを伝えるために使用された嗅覚計は、EAG 実験で使用されたものと同じでした。 イメージングセッション中に、対象の臭気物質（ジェオスミン 10-6、ジェオスミン 10-3、および 10-1 IAA）が単一の臭気または混合物として連続してミツバチに提示され、そのシーケンスが 10 回繰り返されました。 。 各刺激パルスは 3 秒間継続し、刺激間隔は 12 秒で、排気システムが実験エリアから臭気を迅速に除去します。 応答の強さと幅を比較するために、3 つの花の香りも同じシーケンスでテストしました (1-ノナノール 5・10-3、アセトフェノン 5・10-3、および 3-ヘキサノール 5・10-3)。

合計 14 匹のミツバチからの信号が記録され、分析されました。 データ分析は、カスタム MATLAB (R2019b、MathWorks) スクリプトに基づいて完全に自動化されました。 実験シーケンス全体を含む蛍光時系列は、各試行ごとに、刺激前 3 秒、刺激中 3 秒、刺激後 3 秒の期間に分割されました。 各フレームについて、相対的な蛍光変化を計算しました。

生の蛍光信号 \(F\left(t\right)\) を前刺激期間中の平均信号で正規化することにより Fb。 この信号はカルシウム濃度の相対変化、つまりニューロンの発火率に比例します64。 ΔF/F は、臭気ごとに 10 回の試行にわたって平均されました。 次に、2D 活動マップを個々の糸球体反応ごとにセグメント化しました。 糸球体境界は、追加記録された 3D 画像スタックからの解剖学的特徴 (補足図 2a)、機能応答マップ (補足ムービー 2)、および糸球体間の相関関係をテストする領域均一性分析という 3 つの情報源を再帰的に比較することによって取得されました。各ピクセルの信号と隣接するピクセルからの信号。 この測定値は、個々の糸球体内では高く、その境界では低下します（補足図2b）。 一貫して応答する構造がセグメント化された後、デジタル 3D 触角葉アトラス 23 を使用して糸球体の同一性が決定されました。分析は、最も頻繁に識別された 19 個の糸球体に限定されました。 個々の糸球体の同一性を確実に決定できない場合、それらは廃棄されたため、分析された糸球体の総数はミツバチ間で変動しました（図4c）。

単一の臭気に対する被験者の平均反応の統計分析は、FDR 補正を備えた対応のある t 検定によって実行されました。

モデル内のニューロンは、膜電位方程式を使用した適応リーキー積分発火ニューロンによって記述されます。

ここで、 \(\sigma \sim \mathcal{N}\left(\mathrm{0,1}\right)\) は正規分布ホワイト ノイズであり、係数 \(k\) は ORN の入力電流をリスケールするために使用されます。 嗅覚受容体ニューロン (ORN) の場合、入力電流は嗅覚受容体 (OR) および \(k=10\) を通過する電流ですが、局所 (LN) および投射ニューロン (PN) の場合は、入力シナプスからのシナプス電流です。 \(k=1\) とします。 すべてのニューロンは \(C=1\) nF、\({V}_{\text{leak}}=-60\) mV、\({g}_{\text{leak}}=10\) nS を持ちます。 、および \(A=1.4\) nA。 膜電位 \(V\) が発火閾値 \({V}_{th}=-40\) mV を超えるたびに、スパイクが放出され、膜電位は \({V}_{\text{リセット}}=-70\) mV。 PN には適応電流がありませんが、ORN と LN にはスパイク レート適応があり、ORN の場合は \({g}_{\text{adapt}}=1.5\) nS、\({g}_{\text{adapt) になります。 }}=0.5\) LN の場合は nS。 適応変数は次によって支配されました。

ここで、 \(\delta\) はディラック デルタ分布であり、ORN と LN の両方の \({\tau }_{\text{adapt}}=1\) です。

シナプスは、スパイクの到着時にシナプス活性化 \(s\) が瞬時に上昇し、その後指数関数的に減衰することで説明されます。

シナプス後ニューロンへのコンダクタンスベースの入力電流、

興奮性（ORN から PN、ORN から LN、PN から LN）の逆転電位 \({V}_{\text{rev}}=0\) mV および \({V}_{\text{rev}} =-80\) mV (LN から PN へ、および LN から LN へ) 抑制性シナプス。

嗅覚受容体と伝達のプロセスは、標準的な 2 段階の結合および活性化速度モデルによって説明されます (例:65、66、67、68 を参照)。

ここで、 \({r}_{0}\) は結合していない受容体の割合、 \({r}_{i}\) は匂いに結合した受容体の割合 \(i=1, \dots , N\)、 \({r}_{i}^{*}\) は、匂い \(i\) に結合して活性化される受容体の部分です。 定数 \({k}_{1}^{i}\) と \({k}_{2}^{i}\) はそれぞれ、匂い \(i\ への結合および匂いによって活性化される割合を表します) )、\({k}_{-1}^{i}\) と \({k}_{-2}^{i}\) はバインド解除と非アクティブ化について説明します。 すべての \(k\) 定数は、匂いと受容体の種類に固有のものにすることができます。 この研究では、匂いと受容体の種類のペアごとに個別の定数 \({k}_{1}^{i}\) と匂い固有の定数 (ただし、すべての受容体の種類に等しい) \({k}_{2) を選択しました。 }^{i}\)。 \({k}_{-1}^{i}={k}_{-2}^{i}=0.025\) kHz は、すべての匂いと受容体の種類で同一でした。

受容体全体にわたる各臭気物質の個々の結合定数は、ガウス プロファイルとして選択されました。

ここで、 \(\pi \left(\cdot \right)\) は \(1,\dots ,{N}_{\text{glo}}\) と \(\eta\ の (ランダムに選択された) 並べ替えです。 ) は \({\mathcal{N}}_{1.5,{0.5}^{2}}\) の分散確率変数で、\(\left[0, 4\right]\) 内の値に切り捨てられます。 臭気プロファイルの標準偏差 \(\sigma\) は \({\mathcal{N}}_{3,{0.5}^{2}}\) からサンプリングされ、1.5 以上の値に切り捨てられました。単位はkHzです。

各匂いの活性化定数 \({k}_{2}^{i}\) は \({\mathcal{N}}_{0.02,{ 0.02}^{2}}\) からサンプリングされ、次のように切り捨てられました。 \(\left[0.0028, 0.2\right]\) 以内の値 (単位は kHz)。

この作業のシミュレーションでは、これらのルールに従って 98 の臭気と、IAA と Geosmin で特定した 2 つの追加の臭気を生成しました。 「IAA」については、比較的低い感度 \({\eta }^{\text{IAA}}=0.8\) と、狭い応答プロファイル \({\sigma }^{\text{IAA}}) を仮定しました。 =3\)。 アクティベーション率は \({k}_{2}^{\text{IAA}}=0.1\) と非常に高かったです。 「Geosmin」については、高い感度 \({\eta }^{\text{geo}}=4.4\) と幅広い応答プロファイル \({\sigma }^{\text{geo}}=10\) を仮定しました。 )、アクティベーション率は中程度で、 \({k}_{2}^{\text{geo}}=0.003\) でした。 これらのパラメーターの真の値は不明であり、ここで選択された値は、「IAA」および「ジェオスミン」応答が、以下の範囲内で実行可能であることを実証することを目的とした特性 (強力な単調増加応答と濃度の増加に伴う消失応答) を示すように最終的に選択されました。このタイプのモデル。 「IAA」と「ゲオスミン」の匂いを、同じ順列で両方をスクランブルする前に、ピークからピークまで 30 の OR タイプの固定距離で生成しました。 これにより、ORN スパイク数から明らかなように、2 つの匂いが特定の量の重複を持ち、特にアンテナ上の OR での相互作用に影響を与えることが保証されます。

モデル ネットワークを図 4a に示します。 私たちは 160 種類の受容体をシミュレートしました69。 Witthöft70 は、働きバチの触覚に 5,776 個の板状感覚子があり、各感覚子に 12 ～ 20 個の ORN があり、合計で 69,312 ～ 115,520 個の ORN があると報告しました。 数値効率を高めるために、10 倍高い発火率を持つ単一モデル ニューロンで 10 個の ORN をモデル化しました。つまり、タイプごとに 60 個の ORN モデル ニューロン、合計 9600 個です。 これは嗅覚システムのモデリングでは一般的な手法であり、ORN がポアソン過程としてモデル化される場合とまったく同じであり、他のニューロン モデル タイプの適切な近似となります。 ORN はすべて相互作用しないと想定されているため、この単純化が可能であることに注意してください。 AL には推定 800 の PN 71、72 があり、これは糸球体あたり 5 つのシミュレートされた PN と 4000 の LN70、つまり糸球体あたり 25 のシミュレートされた LN に相当します。 非常によく似た公開モデルについては、23 も参照してください。 糸球体の 5 つの PN と 25 の LN はそれぞれ、受容体タイプのランダムに選択された 12 個の ORN に接続されています。 PN はその糸球体のすべての LN を興奮させ、LN はすべての PN と自身の糸球体を除くすべての糸球体の LN を抑制し、一般的に想定される全対全側方抑制のネットワーク モチーフを実装します。 これらの接続のシナプス パラメーターを表 1 にまとめます。すべての微分方程式は、線形オイラー アルゴリズムとグローバル 0.2 ms タイムステップで統合されました。

モデルは、GeNN 4.5.074、75 の PyGeNN インターフェイス 73 を使用して実装されました。 GeNN は https://github.com/genn-team/genn で入手でき、この論文のモデリング作業のソース コードは https://github.com/tnowotny/bee_al_2021 で入手できます。分析とプロット用の Jupyter ノートブックも含まれています。 シミュレーションは、Ubuntu 18.04.5 LTS を実行する Linux ワークステーションで実行されました。

この文脈における応答の単調性 x (x = 最大スパイク密度関数 (SDF) または平均 SDF、それぞれすべての糸球体にわたる) は次のように計算されました。

つまり、テストされた最高の臭気濃度 (\({10}^{-1})\) での SDF と、観測された最高の SDF との差を、観測された SDF の平均値で正規化します。最大値と平均値は、すべての濃度にわたって取得されます。 \({10}^{-7}\) から \({10}^{-1}\) まで。 単調性は 0 以下の値をとり、単調な匂いは \(m=0\) になります。

我々は、スムーズな発射速度の推定値としてスパイク密度関数 (SDF) を計算しました 76。 SDF は、スパイク列 (点プロセスとして理解される) とガウス カーネル関数の畳み込みによって計算されました。

\(\sigma =100\) ミリ秒で。

現在の研究中に取得および分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者 ([email protected]) から入手できます。モデリングのソース コードは https://github.com/tnowotny/bee_al_2021 で入手できます。

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FS は MIUR [PRIN 2017MKNP2F] によってサポートされました。 ET はトレント大学 [戦略プロジェクト BRANDY] によって支援されました。 AC はボルツァーノ自治州 [プロジェクト B26J16000310003] から資金提供を受けました。 ミネソタ州は、Zukunftskolleg (コンスタンツ大学) と Erasmus + Staff Mobility Program からの資金提供によって支援されました。 TN は、EPSRC [P/P006094/1、EP/S030964/1]、レバーフルム トラスト研究プロジェクト助成金、および欧州連合の Horizo​​n 2020 研究およびイノベーション プログラム [助成契約 No 945539 ​​(HBP)] によって支援されました。

アメリ・カビロル

現在の住所: 基礎微生物学部、ローザンヌ大学、CH-1015、ローザンヌ、スイス

トレント大学物理学科、38120、トレント、イタリア

フローレンス・スカラーノ & アルブレヒト・ハーセ

心/脳科学センター (CIMeC)、トレント大学、38068、ロヴェレート、イタリア

フロレンシア・スカラノ、ムキラン・デイバラジャン・スレシュ、エットーレ・ティラボスキ、アメリ・カビロル、アルブレヒト・ハーセ

コンスタンツ大学生物学部、78457、コンスタンツ、ドイツ

モルガン・ヌービアン

フューチャー カレッジ、コンスタンツ大学、78464、コンスタンツ、ドイツ

モルガン・ヌービアン

サセックス大学工学情報学部、ブライトン、BN1 9QJ、英国

トーマス・ノボトニー

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FS は EAG 記録を実行および分析し、MS、AC、および MN は行動実験を実行および分析し、ET はカルシウムイメージング実験を実行および分析し、TN は計算モデリングを開発、実行および分析し、AH は資金と機器を提供し、実験を監督しました。勉強。 著者全員が原稿の準備と改訂に貢献しました。

トーマス・ノボトニーまたはアルブレヒト・ハーセとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Scarano, F.、Deivarajan Suresh, M.、Tiraboschi, E. 他ジェオスミンはミツバチの防御行動を抑制し、異常な神経反応を引き起こします。 Sci Rep 13、3851 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-30796-5

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受信日: 2022 年 10 月 24 日

受理日: 2023 年 3 月 1 日

公開日: 2023 年 3 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30796-5

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