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Jun 03, 2023

高スループット、ラベル

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 13、記事番号: 3385 (2022) この記事を引用

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110 オルトメトリック

メトリクスの詳細

非常にまれな循環腫瘍細胞 (CTC) クラスターは、転移性の高い前駆細胞としてますます評価されていますが、事実上未調査です。 テクノロジーは主に単一の CTC を検出するように設計されており、クラスターの脆弱性を考慮したり、感度を高めるためにクラスター固有のマーカーを活用したりすることができないことがよくあります。 一方、CTC クラスターを対象としたいくつかのテクノロジーはスケーラビリティに欠けています。 ここでは、膜濾過の速度と実用性を、マイクロ流体チップによってもたらされる高感度で決定論的なスクリーニングと組み合わせたクラスターウェルを紹介します。 クラスターウェル内の 100,000 個を超えるマイクロウェルは、未処理の全血中の CTC クラスターを物理的に捕捉し、25 mL/h を超えるスループットで事実上すべてのクラスターを穏やかに分離し、デバイスから生存可能なクラスターを回収できるようにします。 クラスターウェルを使用して、前立腺癌および卵巣癌患者から 2 ～ 100+ 細胞の範囲の CTC クラスターを分離し、RNA シーケンスを使用してサブセットを分析しました。 CTC クラスターを定期的に分離することで、癌の管理​​における CTC クラスターの有用性に関する研究が民主化されます。

がん患者の血流から採取された単一循環腫瘍細胞 (CTC) は、疾患の段階に関する貴重な情報を提供し 1、低侵襲性の予後および診断を可能にし 2,3,4、細胞レベルでの転移に関する理解を深めます 5,6。がんの臨床管理を改善する可能性がある7,8。 これらの単一の CTC に加えて、流通中に付着したままの CTC 凝集体も 1950 年代以来、科学的および臨床的に大きな関心を集めてきました。 これらの CTC クラスター、つまり循環腫瘍微小塞栓は非常にまれですが (全 CTC のわずか 2 ～ 5% と推定されています)、それらは転移の播種において不釣り合いに効率的です。 それらの転移性向は、アポトーシス率が低く、長期生存特性が低いことから、単一 CTC の転移性向よりも 100 倍高いと推定されています 9、10、11。 さらに、患者由来の CTC クラスターのサブセットには宿主免疫細胞が含まれていることが判明し 13,14 、腫瘍と免疫系の相互作用と転移におけるそれらの役割を解明するためのこれらの転移前駆体の有用性が強調されています。 例えば、好中球を運ぶCTCクラスターは、進行乳がん患者において転移能が増加することが示されており14、好中球関連CTCは、増殖マーカータンパク質（Ki67）および細胞周期の進行に関連する遺伝子のより高い発現レベルを示している。 臨床研究はこれらの生物学的研究の結果を裏付けており、CTC クラスターの存在が無増悪生存期間の短縮および患者全体の生存期間の短縮と関連していることが判明しています 15。 したがって、CTC クラスターの研究の増加は、転移の理解と管理の向上に大きな期待をもたらします。

これまでのところ、CTC 分離技術の感度と特異性は主に単一細胞検出用に調整されているため、生存可能な CTC クラスターの信頼性が高く効率的な分離には限界がありました 16、17、18、19。 たとえば、精密濾過技術は、操作が迅速で簡単であるため、CTC アッセイとして広く使用されています 16、19、20。 しかし、生理学的圧力下での CTC クラスターは、一列縦隊の鎖状構造として再編成し、5 μm ほどの狭窄を横切ることができます11。このことは、ろ過に使用されるはるかに高い圧力を考慮すると、凝集体がフィルターの細孔を通過できる可能性が高いことを示唆しています。 さらに、精密ろ過中に受けるせん断力が大きくなると、CTC クラスターが損傷したり、単一細胞に解離したりする可能性があり 21、効率的な濃縮が損なわれる可能性があります。 一方、単一 CTC の単離に長い間使用されてきた抗体ベースの濃縮システム 17、22、23 は、特定の膜抗原への依存性のため、不均一な CTC 集団内の CTC クラスターの選択された部分集団しか検出できません 13 、24。 さらに、CTC クラスターの表面積対体積の比が小さいため、抗体ベースの技術の免疫捕捉効率に悪影響があり 25、CTC クラスターの濃縮が特に非効率的になります。 この点でより有望なのは、特に CTC クラスターをターゲットとした最近のマイクロ流体チップであり、比較的高い感度を達成できます。 残念ながら、それらは臨床的に実行不可能な処理速度 21,26 で行われるか、狭いチャネルでの高い流量によるクラスター損傷の脅威にさらされる 27 か、この懸念は特に大規模なクラスターに関連しており、時には数十個のクラスターで構成されることもあると報告されています。腫瘍細胞の28．

CTC クラスターの分離と研究におけるこれらの制限に対処するために、私たちは Cluster-Wells を開発しました。 この高感度、ハイスループットのポリマーデバイスは、腫瘍特異的抗原を標的にする必要なく、未処理の全血検体から大小さまざまな CTC クラスターを穏やかに分離します。 代わりに、クラスターウェルは、細胞凝集体を物理的に認識し、生理的流量以下の流量下でその完全性を維持するように設計されたマイクロウェル内に CTC クラスターを保持します。 さらに、マイクロウェル内の精製 CTC クラスターに無制限にアクセスできるため、イメージングや機能アッセイ、分子アッセイによるさらなる研究が可能になります。

Cluster-Wells は、血液中の単一細胞を透過させながら細胞凝集体を保持するように設計されたマイクロウェル内に CTC クラスターを捕捉します (図 1a)。 各ウェルの底には、白血球、赤血球、血小板が妨げられずに通過できるサイズの 15 μm × 15 μm の開口部を備えたマイクロメッシュがあります。 したがって、未処理の全血はデバイスを容易に通過できますが、CTC クラスターは大きすぎて単一の開口部に入ることができず、クラスター内の個々の細胞が隣接するメッシュ開口部に留まると捕捉されます。 ウェルに入ると、CTC クラスターは傾斜した側壁によってメッシュ上に拘束され、流れの下での潜在的な再配向が制限され、従来のメンブレンフィルターに見られる損傷を与える横方向の応力から細胞が保護されます。

クラスターウェルの動作原理の概略図。 単細胞は妨げられずに通過しますが、クラスターウェルは、がんの種類や分子の性質に関係なく、がん患者の血液サンプルからの多細胞形態により CTC クラスターを捕捉します。 b 市販のフィルターホルダーで使用される直径 47 mm の膜の形で製造されたクラスターウェルの写真。 拡大画像 (挿入図) は、CTC クラスターを捕捉するように設計された個々のウェルを示しています。 (右) デバイス上のウェルの 1 つによって捕捉された、血液が混入した LNCaP クラスターの走査型電子顕微鏡写真 (「方法」: SEM サンプルの準備とイメージングを参照)。 スケールバー、20μm。 c ポリマークラスターウェルデバイスを成形するために開発された製造プロセスの概略図。 図に示されているステップでは、シリコンモールドの製造プロセスと再利用可能なPDMSモールドの構築が除外されており、これらは補足図に見られます。 微細成形に使用された PDMS 構造 (右下) と、光硬化性ポリマー MD700 から製造された完成したデバイス (左下) の走査型電子顕微鏡写真。 スケールバー、50μm。

メッシュラインは細く（幅約2μm）設計されているため、細胞間のくさびとして機能し、クラスター細胞を異なる開口部に押し込み、細胞間接合部でクラスターを停止させます。 メッシュラインによるクラスターの解離を防ぐために、細胞流速は 65 μm/s まで低く設定され (補足図 1)、これはヒトの毛細血管における生理学的自由流速の約 10 分の 1 です 29。 臨床的に適切なスループット率を達成しながら、CTC クラスターの穏やかな取り扱いを維持するために、私たちは多数のクラスター捕捉井戸を並行して運転しました。 指定された流量でも、120,000 個のマイクロウェルが直径 47 mm の膜上に均一に広がり、25 mL/h の処理速度が得られました (図 1b)。

当社は、クラスターウェルを使い捨てポリマーデバイスとして設計し、迅速かつ低コストでの製造を保証し、さまざまな研究や臨床現場でこの技術を利用できるようにしました。 微細加工プロセスでは、シリコンマイクロマシニング 30、ソフトリソグラフィー 31、および微細成形技術 32 を組み合わせました (「方法」: シリコンマスターモールドの微細加工およびシリコンマスターからのクラスターウェルの成形を参照)。 まず、ウェットおよび反応性イオンエッチングステップによる薄膜堆積を含む3マスク微細加工プロセスを使用して、シリコンからネガモールドを製造しました（補足図2）。 次に、シリコン型をポリジメチルシロキサン (PDMS) に転写し、ソフト リソグラフィーを使用して複製しました。 得られたネガティブ PDMS モールドに光硬化性ポリマー (Fluorolink MD700、Solvay) を充填し、モールド内で架橋してデバイスを形成しました (図 1c)。 作製されたデバイスの厚さは 65 μm で、構造的に剛性が高く、取り扱いが容易でした。 このプロセスにより、シリコンマイクロマシニングでのみ実現可能な複雑な形状を、手頃な価格の使い捨てプラスチックデバイスに転写することができます。

Cluster-Wells の動作をテストして最適化するために、IRB が承認したプロトコールに従って、健康なドナーから収集した血液サンプルに人工的に形成されたヒトがん細胞株のクラスターをスパイクして調製したサンプルを処理しました (「方法」を参照: 細胞培養と調製およびサンプルコレクション）。 これらの実験では、腫瘍細胞クラスターを蛍光色素で事前または事後標識して、確実に識別しました。 クラスターを添加した全血を市販のフィルターホルダーに配置したクラスターウェルに通した後、リン酸緩衝食塩水 (PBS) で洗浄し、デバイス上の細胞を免疫蛍光染色しました。 捕捉されたクラスターは、蛍光顕微鏡検査によってマイクロウェル内で特定されました（図2a）。

a 未処理の全血に添加された、捕捉された LNCaP クラスターの代表的な蛍光画像。 PBS で洗浄および固定した後、単離した腫瘍細胞をサイトケラチン (緑色) および DAPI (核、青色) で染色しました。 スケールバー、20μm。 b 特性評価研究に使用される実験装置の概略図。 クラスターウェルの分析バージョンに出入りする細胞を視覚的に追跡し、2 チャネルマイクロ流体インターフェースを使用して捕捉効率計算のために計数しました (「方法」: デバイス感度の測定を参照)。 c さまざまな流量でのスパイクされた LNCaP クラスターのクラスター捕捉効率。 データはクラスター内の細胞の数に従って提供されます (n = 3 回の独立した実験)。 データは平均値 ± SD として表示されます。 d 25 mL/hの流速での前立腺がん細胞クラスター（LNCaP）、乳がん細胞クラスター（MDA-MB-231 & MCF-7）、および卵巣がん細胞クラスター（HeyA8）の2細胞クラスター捕捉率（n = 3の独立した実験） 。 データは平均値 ± SD として表示されます。 Cluster-Wells はクラスターの物理的属性のみに依存するため、表面抗原とは無関係に、さまざまな種類の腫瘍のクラスターを効率的に捕捉しました。 e 異なる開口部サイズを持つデバイスの 2、3、および 4 セル LNCaP クラスターの捕捉効率 (n = 3 の独立した実験)。 実験は 25 mL/h の流速で実行されました。 データは平均値 ± SD として表示されます。 f 未処理全血のチューブ (10 mL) を処理した後の、さまざまな開口部サイズのデバイスの白血球 (WBC) 保持率 (n = 3 の独立した実験)。 非特異的に付着した WBC を染色し、計数しました。 保持率の計算では、得られた白血球数を、全血球計算 (CBC) 分析装置から取得したデバイスを通過した白血球の総数で割りました。 データは平均値 ± SD として表示されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

異なる流量下でのクラスターウェルの捕捉効率を決定するために、デバイスに出入りするスパイクされたクラスター集団を画像化して比較しました。 私たちは、処理された各クラスターを顕微鏡下で画像化するための2チャネルのマ​​イクロ流体インターフェースを構築しました。これにより、同じ視野内で全血中の蛍光癌細胞の出入りを同時に追跡できるようになりました（図2b）（「方法」を参照） ：デバイスの感度の測定）。 これらの実験では、細胞間の視覚的な区別を改善し、クラスター内の細胞のより正確な計数を容易にするために、細胞膜や細胞質ではなく細胞核を染色しました。 さらに、イメージング速度は、(1) 各クラスターの複数 (>4) ショットを確保し、どのクラスターも見逃されないようにし、(2) 視野内で複数の異なる構造を捕捉して、クラスターの精度を向上させるのに十分な高速に設定されました。サイズの見積もり。 デバイスを取り付けずにループ内で 2 チャネルのマ​​イクロ流体インターフェースを操作して、システム内に細胞損失がないことを確認し (補足​​表 1)、また、最適化された特性評価セットアップを検証しました (「方法」: デバイス感度の測定を参照)。セットアップを使用して取得したクラスター数が、デバイス上でキャプチャされたクラスターの直接数と一致していることを確認することで (補足図 4)。

Cluster-Wells を使用して、ヒト前立腺がん細胞 (LNCaP) のクラスターを添加した全血サンプルを 25 ～ 750 mL/h の範囲の速度で処理しました (図 2c)。 25 mL/h では、デバイスはほぼすべてのクラスターを分離し、ダブレットの約 6.8% のみを損失しました。 わずか約 2 分で全血チューブのスクリーニングを可能にするスループット 250 mL/h では、細胞は依然として生理学的流速でマイクロウェルを通過し、デバイスは 6 個以上の細胞からなる腫瘍細胞クラスターをすべて捕捉しました。 、5 セル クラスターの ~98.7%、4 セル クラスターの ~93.8%、3 セル クラスターの ~89.3%、ダブレットの ~75.8%。 流速 > 500 mL/h の場合にのみ、スパイク細胞集団と処理細胞集団のサイズ分布の間で観察された不一致によって証明されるように、スパイク細胞クラスターはデバイス内で解離しました (補足図 5)。

さまざまな種類のがんの腫瘍細胞クラスターを処理する際のデバイスの感度を調査するために、乳がん細胞株 (MDA-MB-231 および MCF-7) および卵巣がん細胞株 (HeyA8) のクラスターを添加したサンプルも処理しました。 これらの腫瘍細胞は、以前に検査された前立腺がん細胞とは異なる生化学的および生物物理的特性を持ち、また細胞間の親和性も異なります。 それでも、クラスターウェルは、25 mL/h で、すべての腫瘍細胞株において最も回避性の高いクラスタータイプであるダブレットの 90% 以上を捕捉しました。これは、この技術がさまざまな組織の癌に適用できることを裏付けています (図 2d)。 デバイスの測定感度を大局的に見ると、Cluster-Wells は、同様のサイズの Cluster-Chip21 の 2 倍の感度でダブレットを捕捉します。このデバイスは、単一 CTC に最適化された技術よりもクラスターの捕捉感度が高いことがすでに示されています。 、血液を10倍速くスクリーニングしながら（補足図6）。 実際、両方のプラットフォームが同じ流量 (50 mL/h) でサンプルをスクリーニングすると、クラスターウェルの公表されている捕捉率 21 に基づいて、クラスターウェルはほぼ 1 桁 (約 9 倍) 高い効率で最小クラスターを捕捉します。 -チップ。 100 mL/h のスループットで全血をスクリーニングする場合でも、Cluster-Wells はどの CTC クラスター濃縮方法よりも感度が高く、ダブレットの約 10.4%、トリプレットの約 2.7% のみを欠落します。

CTC クラスター分離用にデバイスの形状を最適化するために、マイクロメッシュ開口部のサイズがデバイスのパフォーマンスに与える影響を調査しました。 この論文で説明したクラスターウェルに加えて、より小さな開口部 (13.5 μm) を備えたバージョンと、より大きな開口部 (16.5 μm) を備えたバージョンを設計しました。 ヒト前立腺がん細胞（LNCaP）を添加した全血を用いて再度テストしたところ、調整された開口部サイズがクラスター捕捉感度と特異性の間にトレードオフをもたらすことがわかりました。 25 mL/h でテストした各デバイスは、より大きな (4 細胞以上) クラスターをすべて捕捉できましたが、16.5 μm メッシュではダブレット捕捉効率が約 20% 減少し、3 細胞クラスターでは約 2.5% 減少しました。キャプチャ（図2e）。 逆に、開口部を 13.5 μm に減少させると、ダブレット捕捉効率が約 5% 増加し、合計で約 98% の捕捉が可能になりました。 ただし、メッシュ開口部が小さくなると特異性も低下し、平均して白血球の混入が最大60％増加します（図2f）。 しかし、ほとんどの白血球は機械的に捕捉されず、ランダムな位置で非特異的に表面に付着するため、メッシュ開口部を増やすと特異性の向上が減少します。より大きなメッシュ開口部 (16.5 μm) では、白血球の汚染はわずか約 20% しか減少しませんでした。 収集した純度データと捕捉効率データの両方を比較検討した結果、15 μm メッシュ開口部が最適な設計選択であると特定しました。これにより、平均汚染率は約 28.8 白血球 (WBC)/mm2 (<0.06%)、約 331 個の血小板が得られました。当社のテストでは、未操作の全血サンプル 10 mL の処理から /mm2 (<0.025%) が得られました。

生存可能な CTC クラスターの放出は、下流の分子アッセイおよび機能アッセイにとって極めて重要であるため、フッ素ベースの低表面エネルギーポリマー (Fluorolink MD700、ソルベイ) からクラスターウェルを構築し、非特異的な細胞接着を最小限に抑えてクラスターの回収を向上させました。 PDMSベースのデバイスの欠点21。 Cluster-Wells の放出性能を評価するために、デバイス上に捕捉された生存可能な腫瘍細胞クラスターの回収を試みました (図 3a)。 LNCaP クラスターを添加した全血サンプルを 25 mL/h で処理した後、クラスターウェルを PBS で洗浄し、さまざまな逆流速度でクラスターをペトリ皿に放出しました。 蛍光顕微鏡を使用して、各テスト速度で収集ペトリ皿内に正常に放出されたクラスターとデバイス上に残ったクラスターの両方を特定し、クラスター放出効率を計算して最適な逆流速度を決定しました。 逆流速度が速くなると放出効率が向上し、デバイスに非特異的に付着したクラスターがより多く除去されました。 私たちは、マイクロウェル内の平均逆流速度約6.5 mm/s（捕捉流速の100倍）で約10秒間、クラスターのほぼすべて（約96％）を正常に回収できると結論付けました（図3b）。 。 さらに、捕獲されたクラスター集団と解放されたクラスター集団のサイズを直接比較することにより、解放されたクラスターの完全性が保存されていることを確認しました（補足図7）。

a リリースプロセスの表現。 LNCaP クラスターを全血に添加し、Cluster-Wells を使用して処理しました。 PBS 洗浄後、捕捉されたクラスターを逆流を適用してペトリ皿に放出しました。 b 異なる相対逆流速度でのデバイスの放出効率。 放出後、蛍光顕微鏡を使用してペトリ皿とデバイスの両方を画像化し、放出効率を計算するために手動で細胞をカウントしました (n = 3 の独立した実験)。 データは平均値 ± SD として表示されます。 c 逆流速度6.5 mm/sでペトリ皿に放出された対照およびクラスターの生存率（n = 3の独立した実験）。 2 色生存率テストは、ペトリ皿内の対照および放出された細胞に対して実行され (「方法」: 細胞生存率の測定を参照)、続いて蛍光顕微鏡を使用してスキャンされました。 生細胞と死細胞の数を数えて、生細胞の割合を計算した。 データは平均値 ± SD として表示されます。 d クラスターウェルと個々のマイクロウェル内のマイクロマニピュレーターのキャピラリーの写真。 マイクロ流体デバイスとは異なり、マイクロマニピュレーターを使用して個々のマイクロウェルに簡単にアクセスできます。 e フィルターホルダーから取り外した後のクラスターウェルの蛍光顕微鏡画像。 表面張力により、以前に導入された蛍光色素溶液はウェル内に留まり、マイクロマニピュレーターを使用して個々のマイクロウェルの内容物を取り出すことができます。 マイクロウェルを放置すると、約 10 分で乾燥します。 スケールバー、50μm。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

Cluster-Wells の測定された回収効率は、以前に報告された PDMS ベースの Cluster-Chip21 のクラスター回収率よりも高いです。 私たちの実験でクラスターチップについて報告された試験条件を模倣し、クラスターウェルを使用してMDA-MB-231クラスターを添加した血液サンプルを処理し、捕捉された凝集体の放出を試みました。 以前にクラスターチップで適用したのと同じ逆流速度 (6.5 mm/秒) と時間を使用して、クラスターチップの 2 倍を超える効率 (87% 対 37%) でクラスターウェルからクラスターを回収することができました。 (補足図8)。 マイクロ流体チップへの非特異的細胞接着を低減するために 4 °C で操作したクラスターチップの報告された放出効率と比較した場合でも、クラスターウェルはより高い効率を示しました (クラスターウェルの回収率 87% に対し、クラスターウェルの回収率 80%)。クラスターチップ）。

次に、生細胞/死細胞アッセイを使用して、クラスターウェルから捕捉され、その後放出された腫瘍細胞の生存率を調査しました（「方法」を参照：細胞生存率の測定）（補足図9）。 これらの測定では、クラスターウェルによってスパイク血液サンプルから捕捉された LNCaP クラスターを 6.5 mm/s の逆流下で放出しました。 放出されたクラスターの平均生存率（約95.8％）は、対照集団の平均生存率（約96.3％）と同様であることが判明し、デバイスも放出プロトコルも細胞生存率に顕著な影響を与えなかったことを実証しました（図3c）。

細胞を回収するためにクラスターウェルの露出したレイアウトを利用できるかどうかを評価するために、マイクロマニピュレーターを使用して生存可能なクラスターをマイクロウェルから直接捕捉できるかどうかも調査しました（図3d）。 まず、デバイスが顕微操作用にセットアップされている間、捕捉されたクラスターがマイクロウェル内に安全に保持できるかどうかをテストしました。 暴露されたデバイス上でイメージ化されたクラスターの数とスパイクされたクラスターの数を比較することにより、クラスターの大部分 (約 95.8%) が暴露されたデバイス上に保持されていることがわかりました。 次に、多孔質マイクロウェルを備えたデバイスがフィルター ホルダーから取り出して露出すると早期に乾燥し、生存可能なクラスターの収集が妨げられるかどうかを判断する別のテストを実行しました。 クラスターウェルを蛍光色素溶液で満たしたところ、デバイスの疎水性と表面張力の組み合わせにより、重力下で液体がマイクロメッシュから漏れるのが防止されることがわかりました（図3e）。 さらに、露出したデバイスの表面で液体が蒸発すると、マイクロウェルが最後に乾燥し、ウェル間に自然な隔離がもたらされ、クロストークなしで内容物を収集できるようになりました（図3e）。

このデバイスの臨床応用の可能性を評価するために、Cluster-Wells テクノロジーを適用して、卵巣がん患者および前立腺がん患者の血液サンプルから CTC クラスターを分離しました。 2.8 ～ 24 mL の血液サンプルは、エモリー大学およびノー​​スサイド病院で治験審査委員会が承認したプロトコールに従って、同意した患者から採取され、採取後 4 時間以内にジョージア工科大学で処理されました (「方法」: サンプル採取とサンプルを参照)処理）。 単離された細胞を 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で固定した後、サンプルを白血球マーカーで免疫染色し、特定の疾患について確立された癌マーカーに対して免疫染色しました。 核染色 (4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール) も適用して、患者の CTC クラスターを明確に同定しました (「方法」: CTC クラスターの免疫蛍光染色を参照)。 次に、免疫染色されたクラスターを画像化し、蛍光顕微鏡下でクラスターウェルをスキャンすることによって分析しました。 アッセイの特異性は、健康なドナーの血液サンプル 10 mL (各 n = 3) を処理することによって両方のがんタイプについて検証され、すべてのサンプルに CTC クラスターが存在しないことが確認されました。

我々は、卵巣がん患者の血液サンプル（図4a）と前立腺がん患者の血液サンプル（図4b）の両方でCTCクラスターを検出しました。 これらのクラスター内の細胞数は 2 個から最大で 150 個を超える細胞までの範囲であり、後者は卵巣がん患者からのサンプルで見つかりました (図 4a、iii)。 CTC クラスターの生理学的循環に関する疑問を引き起こすことに加えて、分離された卵巣がん CTC クラスターのサイズが驚くほど大きいことは、たとえ CTC クラスターを念頭に置いて設計されていたとしても、マイクロ流体チップの潜在的な欠点を示しています。このサイズの CTC クラスターでは、狭いマイクロ流体チャネルが詰まっているか、無理に通過すると小さな断片に分裂する可能性があります。 分離された CTC クラスターの一部には、卵巣がんサンプルと前立腺がんサンプルの両方に白血球が含まれていることがわかりました (図 4a、ii および b、iii)。この観察は、乳がん CTC クラスターに関する以前の報告と一致しています 14。 これらの白血球関連 CTC クラスター内の細胞間の物理的結合を確認するために、このようなクラスターを意図的にマイクロウェルから排出し、その後再捕捉しました。

a 卵巣がん患者から分離された CTC クラスターの蛍光顕微鏡画像。 捕捉された細胞は、サイトケラチン、ビメンチン (緑色)、CD45 (赤色)、および DAPI (核、青色) で染色されました。 スケールバー、20μm。 b 転移性前立腺がん患者から分離された CTC クラスターの画像。 捕捉された細胞は、サイトケラチン、ビメンチン、PSA/KLK3、EpCAM (緑色)、CD45 (赤色)、および DAPI (核、青色) で染色されました。 スケールバー、20μm。 c 同じ時点で卵巣がん患者の腹腔から採取された末梢血および腹水サンプルから単離されたクラスター。 単離された CTC クラスターは、同じ患者の腹水サンプルから単離された腫瘍スフェロイドと比較して形態学的に異なっていました。 腹水サンプルからのスフェロイドはサイトケラチン、EpCAM (赤)、CD45 (緑)、および DAPI (核、青) で固定および染色され、血液サンプルから分離された CTC クラスターは固定され、サイトケラチン、ビメンチン (緑)、CD45 (赤）とDAPI（核、青）。 スケールバー、20μm。 d 血液サンプル中に CTC クラスターが観察された前立腺がん患者 (n = 8) および卵巣がん患者 (n = 9) の割合。 e 前立腺がん患者および卵巣がん患者からの血液サンプル 1 ミリリットルあたりに観察される CTC クラスターの数。 f 前立腺および卵巣の CTC クラスターで観察された細胞数の分布。 箱ひげ図は 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルを示し、線は中央値を示し、ひげは最大点と最小点を示します。 g 各疾患タイプの純血球および白血球関連 CTC クラスターの割合。 h 卵巣がん患者から単離され、蛍光ベースの生存率アッセイに供された CTC クラスターの画像。 画像は、(i) 生細胞と死細胞 (黄色) の両方、および (ii) 生細胞のみで構成された CTC クラスターを示しています。 スケールバー、20μm。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

全血以外の体液から細胞凝集塊を単離する際のクラスターウェルの適用性をテストするために、卵巣がん患者から採取した腹水サンプルから腫瘍スフェロイドを単離することを試みました（「方法」：サンプル処理を参照）。 腹水サンプルで観察された腫瘍細胞スフェロイドの濃度は、同じ患者から同じ時点で採取された末梢血サンプルで観察された CTC クラスターの濃度と比較して、有意に高かった (~1500 スフェロイド/mL 対 0.167 CTC クラスター/mL)。 さらに、単離されたスフェロイド内の腫瘍細胞は、血液サンプルから単離したCTCクラスター内の腫瘍細胞よりも形態学的に大きいことが観察されました（図4cおよび補足図10）。

私たちが研究した患者コホート（補足表2および3）のうち、CTCクラスターは前立腺がん患者8人中6人、卵巣がん患者9人中8人で検出されました（図4d）。 検出されたCTCクラスターの数は患者間で大きく異なり、濃度は前立腺がん患者では0.063〜0.867クラスター/mL、卵巣がん患者では0.167〜59.2クラスター/mLの範囲でした（図4e）。 平均して、卵巣がんのCTCクラスターは前立腺がんのCTCクラスターよりも多くの腫瘍細胞で構成されており、中央値は前立腺がんの3細胞に対して6細胞でした（図4f）。 さらに、単離された卵巣癌 CTC クラスターの 26.4% には WBC が含まれており、前立腺癌 CTC クラスターの 16.4% には WBC が含まれていることがわかりました (図 4g)。 まとめると、クラスターウェルによって単離された CTC クラスターで観察された表現型の不均一性は、この技術によって提供される高いダイナミック レンジと穏やかな処理条件を証明しました。 また、異なるコホートではあるものの、クラスターチップと比較してクラスターウェルによって検出される前立腺がんクラスターの濃度が高い (0.43/mL 対 0.28/mL21) ことは、潜在的にクラスターウェルの優れた分離効率によるものである可能性があります。 、前立腺がんの CTC クラスターのサイズが小さいことを考えると。

重要なことに、CTC クラスターは卵巣がん患者コホートで特に多く発生しており、平均濃度は 10.32 クラスター/mL でした。 卵巣がん患者における CTC クラスターの発生率の高さは、特に卵巣がんにおける単一 CTC に関する以前の研究 33 を考慮すると、卵巣がん細胞の非常に効率的な血管内侵入能力を示唆しています。 さらに、卵巣がん患者の 1 人からの CTC クラスターの生存率を調査することにより (「方法」: 患者サンプルから分離された CTC クラスターの生存率評価を参照)、Cluster-Wells によって分離された CTC クラスターには生存可能な腫瘍細胞が含まれていることがわかりました (図 4h)、この技術によって提供される迅速かつ穏やかな濃縮の利点がさらに強調されました。 したがって、全体として、生存可能な CTC クラスターの分離は、卵巣がんの診断と監視に特に有用である可能性があります 34。

Cluster-Wells を使用して下流の分子アッセイ用に生存可能な CTC クラスターを単離する実現可能性を実証するために、2 人の前立腺がん患者からの個々の CTC クラスターに対して RNA シーケンスを実行しました (「方法」: RNA ライブラリーの調製とシーケンスおよび RNA シーケンス データ分析を参照)。 クラスターウェル上の未固定細胞を最初に腫瘍特異的膜抗原および白血球マーカーに対して免疫染色し、マイクロマニピュレーターを使用して配列決定するために蛍光CTCクラスターをマイクロウェルから直接採取しました（図5a）（「方法」を参照：CTCクラスターのマイクロマニピュレーション）患者サンプルから)。 分子研究用のサンプルは表面マーカーのみをターゲットとした異なる染色プロトコルにさらされたため（図5b）、前立腺がん患者のCTCクラスターの列挙には含まれていませんでした。

a 転移性前立腺がん患者 (患者-1) の血液サンプルから分離された CTC クラスターの顕微操作。 血液濾過と PBS 洗浄後、単離された生存 CTC クラスターを、EpCAM および前立腺特異的膜抗原 (PSMA) に対する FITC 結合抗体を使用してデバイス上で染色し、蛍光顕微鏡を使用してスキャンし、デバイスから直接顕微操作しました。 スケールバー、50μm。 b RNA-Seqを行った前立腺CTCクラスターの代表的な蛍光顕微鏡画像。 画像は、分子分析のためにデバイスから取得される前に撮影されました。 スケールバー、20μm。 c 配列決定された患者クラスター、前立腺がん細胞株、および白血球の t 分布確率的近隣埋め込み (t-SNE) プロット。 d 2人の転移性前立腺がん患者、前立腺がん細胞株、および白血球から単離されたCTCクラスターにおける選択された遺伝子の発現レベルを示すヒートマッププロット。 100 万あたりの RPM 読み取り。

合計 6 つの CTC クラスターが 2 人の前立腺癌患者、2 セットの WBC、および LNCaP および PC-3 前立腺癌細胞株からそれぞれ 2 つのクラスターから配列決定されました。 患者クラスターから、サンプルあたり 8315 万リードの中央値、独自にマッピングされたリードの中央値 7400 万リード (約 88.8%)、および平均配列品質の平均 Phred スコア 36 を取得しました。 合計 16,412 個の固有の転写物を検出し、検出された転写物のセット全体を使用して t-SNE 分析を実行し、患者クラスターを対照の WBC および前立腺がん細胞株と比較しました (図 5c)。同じものから異なるクラスターが存在することを観察しました。患者または細胞株は一緒にクラスター化する傾向がありました。

まず、患者クラスターと WBC を比較する DESeq2 分析 35 を実行して、差次的に発現した転写物を特定し、合計 3718 個の転写物を特定しました (p-adj < 0.01)。 検出された転写物のランク付けされたリスト全体が、WebGestalt37 を使用した遺伝子セット濃縮分析 36 に使用され、MYC 標的遺伝子、G2M チェックポイント遺伝子、E2F 標的、エストロゲン応答遺伝子など、患者クラスターで濃縮された多数の非常に重要な遺伝子セットが観察されました（補足図。 12 および 13) Hallmark 50 遺伝子セットおよび KEGG 経路遺伝子セット コレクションから。 これらの遺伝子セットは、悪性腫瘍細胞などの増殖性のホルモン駆動細胞と一致しています 38、39、40。 さらに、患者クラスターでは、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性遺伝子、移植片対宿主病遺伝子、インターフェロンガンマ応答遺伝子、Th1/Th2分化遺伝子などの免疫細胞関連遺伝子セットがネガティブに濃縮されており、これは、免疫細胞関連遺伝子セットのトランスクリプトームが重要であることを示唆している。これらのクラスターは、宿主の健康な免疫細胞とは異なりました（補足図14）。

前立腺癌の選択された遺伝子セットに対応する転写産物の分析により、すべてのCTCクラスターが高レベルの上皮マーカーを発現していることが示されました（図5d）。 上皮マーカーの中で、上皮細胞接着分子 (EpCAM)、E-カドヘリン (CDH1)、およびサイトケラチン (KRT) 8、18、および 19 はすべての CTC クラスターで高度に発現していましたが、特に患者 2 の CTC クラスターも同様でした。 KRT5を発現させた。 間葉マーカーの中で、上皮間葉移行 (EMT) の誘導の指標であるビメンチン (VIM) 41 は、ほとんどの CTC クラスターで比較的低いが検出可能なレベルで発現されました。 確立された腫瘍マーカーに加えて、患者クラスターでは幹細胞および増殖関連マーカーもスクリーニングされました。 幹細胞マーカーのうち、CD24 はすべての CTC クラスターでさまざまなレベルで発現していましたが、5/6 クラスターでは高レベル (>50 rpm) の CD44 を発現していることがわかりました。 CD44 同種親和性相互作用とそれに続く CD44-PAK2 相互作用が腫瘍細胞の凝集を媒介し 42、幹細胞性、生存率、転移の進行を改善することが以前に報告されています 43,44。 同様に、すべての CTC クラスターは、細胞増殖を刺激し、アポトーシスを阻害し、血管新生を調節することが知られている TIMP1、JUN、および FOS を高レベルで発現しました 45,46。 さらに、Broad Institute の MSigDB データベースからの「TOMLINS_PROSTATE_CANCER_UP」遺伝子セットの過剰表現エンリッチメント分析を実行しました。このデータベースには、良性組織と比較して前立腺がんで上方制御されている遺伝子がリストされています 47。 ヒートマップ プロットから観察されるように、すべての CTC クラスターおよび前立腺がん細胞株は、前立腺腫瘍の起源と一致して、これらの遺伝子を高レベルで発現しました。 また、MSigDB データベースの「CHANDRAN_METASTASIS_TOP50_UP」遺伝子セットについても同様の分析を実施しました。これには、原発組織と比較して転移性前立腺がん腫瘍で上方制御されている遺伝子が含まれています 48。 すべてのクラスターにおける転移に関連する遺伝子の上方制御は、CTC クラスターの転移能の増強と一致しています 9,10。 このセットの中で、さまざまな種類のがんにおけるがんの発生と浸潤、進行、転移、および薬剤耐性に重要な役割を果たしている熱ショックタンパク質（HSP）のメンバーである HSPD1 および HSP90AA1 遺伝子の発現レベルが最も高いことが観察されました 49,50。 また、すべての CTC クラスターは高レベルの G3BP1 を発現しており、これは腫瘍の悪性度と相関しており 51、去勢抵抗性前立腺がん (CRPC) で最も豊富に存在することが観察されています 52。これは患者 1 と患者 1 の両方の臨床診断と一致します。患者-2 (補足表 2)。

この研究では、がん患者の未処理の血液サンプル中の CTC クラスターを選択的に検出する細胞分離技術を紹介します。 クラスターウェルは、ポリマー膜上にエッチングされた人工マイクロウェルに CTC クラスターを直接捕捉することにより、血液サンプル中のこれらの転移性前駆体を見つける他の方法よりも優れた利点を提供します。 第一に、血液成分を並行してスクリーニングする膨大な数のマイクロウェルにより、臨床サンプルを数分で分析することが可能になると同時に、生理学的循環よりも遅い流速のみにさらすことで CTC クラスターの完全性を確保します。 第二に、平面デバイス形式により、CTC クラスターとの接触面で直接マイクロウェル トラップの成形が可能になり、クラスターとトラップの相互作用のランダム性が排除され、ダブレットさえも高感度で捕捉できるようになります。 第三に、従来のメンブレンフィルターではなくマイクロウェルに CTC クラスターを分離することで、処理中または処理後の外部ストレスから CTC クラスターを保護し、下流のアッセイにアクセスできるようにし、細胞をディッシュにプレーティングする必要がなくなります。 最後に、開発された CTC クラスター アッセイは、市販のフィルター ホルダーのみを必要とし、ポンプ以外の追加の特殊なハードウェアを必要としないため、基礎研究や臨床ワークフローに容易に統合できます。

臨床血液サンプルにクラスターウェルを使用したところ、前立腺がん患者と卵巣がん患者の両方で CTC クラスターが発見されました。 注目すべきことに、ほとんどの卵巣がん患者の末梢血中に比較的高濃度のCTCクラスターが見つかった。 腹腔内の周囲臓器への卵巣がんの広がりは主に腹水中の細胞凝集体によって媒介されると考えられており、腹水中の細胞凝集体の存在は化学療法抵抗性の再発と不良な予後と関連しているため、この発見は重要である53,54。 CTC クラスターは腹水中の腫瘍スフェロイドよりも小さな細胞で構成されていることが判明しましたが、試験したサンプルでは細胞が 150 個を超える大きさでした。この 2 つの観察は一見互いに矛盾しており、腹水中の CTC クラスターの循環に潜在的な影響を及ぼします。体。 卵巣がん患者の末梢血における CTC クラスターの頻度は、卵巣がんの血行性播種をより深く理解するためのさらなる研究の貴重な機会を提供する可能性がある55。また、卵巣がんの 2 つの主要な問題領域である疾患の発症と腫瘍再発を早期に検出する機会も提供する可能性があります。この病気は進行/再発の初期段階では無症候性であるため 56。

マイクロウェルから収集された個々の CTC クラスターの RNA シーケンスにより、患者間の腫瘍の不均一性だけでなく、患者内の CTC クラスターの不均一性も調査することが可能になり、通常は組織レベルの分析では隠されている特徴が明らかになりました。 分離されたすべての前立腺がんクラスターは、さまざまなレベルで上皮マーカーを強く発現する一方、間葉マーカーの発現は低いことが判明しました。 各患者クラスターは、前立腺癌で上方制御されていると報告されている遺伝子のほとんどを一貫して発現していることが判明し、前立腺腫瘍の起源としての同一性と一致しています。 さらに、すべての単離された CTC クラスターにおける幹細胞関連マーカーの上方制御および前立腺腫瘍細胞の浸潤に関連する遺伝子の高い発現レベルは、これらの細胞凝集体の転移成功が大幅に向上したことに関する以前の報告と一致しました。 これらの共通の特徴に加えて、個々の CTC クラスターからのトランスクリプトームの比較分析により、異なる患者固有のプロファイルも明らかになりました。 最初の患者から単離されたクラスターは AR、KLK3 (PSA)、または FOLH1(PSMA) を発現し、前立腺がん細胞の陽性対照の 1 つとして配列決定されたアンドロゲン応答性 LNCaP 細胞と同様のプロファイルを示しました。 対照的に、2番目の患者から分離されたクラスターのすべてでは、これらの前立腺特異的遺伝子は、アンドロゲン非依存性PC-3細胞と同様に下方制御されていることが判明し、これらは私たちの研究では他のポジティブコントロール前立腺癌細胞型として含まれていました。 。

Cluster-Wells は、腫瘍特異的標識に依存することなく、未処理の全血サンプルから無傷の CTC クラスターを迅速にスクリーニングして高感度に分離することを可能にし、異種がん細胞の効率的な分離を最大限に高めます。 クラスターウェルは、高分子膜フィルター上に設置された精密に設計されたクラスタートラップのバッチを使用して、最も壊れやすい CTC クラスターも捕捉して保存し、さらなる調査に備えます。 Cluster-Wells は、サンプル前処理、複雑な技術トレーニング、ポンプ以外の特殊な機器を必要とせずに、臨床または研究のワークフローに簡単に統合できるため、がん転移における CTC クラスターの役割に関する研究の民主化に役立つツールです。また、病気を管理するための予後マーカーとしての臨床的有用性も確立しています。

同意した健康なドナーからの血液サンプルはジョージア工科大学で収集されました。 この研究には7人の健康な参加者（男性5人、女性2人、年齢範囲24～37歳）が含まれていた。 前立腺がん患者の血液サンプルはエモリー大学病院とグレイディ記念病院で収集され、卵巣がん患者の血液および腹水サンプルはノースサイド病院で収集されました。 この研究には、前立腺がん患者10人（男性、年齢範囲59～71歳）と卵巣がん患者10人（女性、年齢範囲27～78歳）が含まれていた。 すべての収集は、ノースサイド病院、エモリー大学、ジョージア工科大学の治験審査委員会によって承認されたプロトコールに基づいて実行されました。 参加者には登録に対する報酬は支払われなかった。

マスターモールド、つまりクラスターウェルのネガパターンは、3マスクプロセスを使用して、厚さ500μm、直径4インチの（100）シリコンウェーハから製造されました（補足図2）。 SC1813 フォトレジスト (Shipley、マサチューセッツ州マールボロ) を最初のマスクとして使用しました。 フォトレジストの回転とパターニングに続いて、ディープ反応性イオンエッチング（DRIE）を使用してSiウェハを8μmの深さまでエッチングして、四角柱を形成しました。 次に、低応力窒化物の薄層 (300 nm) が LPCVD 炉内で堆積されました。 堆積された窒化物をパターン化するために、ウェーハをＳＰＲ ２２０－７．０ポジ型フォトレジスト（Ｓｈｉｐｌｅｙ、マサチューセッツ州マールボロ）でコーティングし、マスクレスアライナー（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ＭＬＡ１５０）によって露光した。 露出領域の下の窒化物層を反応性イオンエッチングを使用してエッチングして、ウェットエッチングプロセス用のハードマスクを形成した。 シリコンを 45% KOH 溶液中で 80 °C で 15 分間異方性エッチングして、傾斜壁を形成しました。 最後に、マイクロウェルのネガパターンを形成するために、SPR 220-7.0 フォトレジストをマスクとして使用し、DRIE を使用してウェーハに深さ 50 μm の正方形のトレンチをエッチングしました。 ピラニア（濃硫酸（H2SO4）と過酸化水素（H2O2）の3：1混合物）を120℃で10分間洗浄した後、微細加工されたシリコンウェーハを真空条件下で8時間トリクロロ（オクチル）シランでコーティングしました。 PDMS キャスティングに。

シリコンマスターモールドの微細加工（方法：シリコンマスターからのクラスターウェルの成形、補足図2を参照）に続いて、ポリジメチルシロキサン（PDMS）モールドの準備とポリマーデバイスのパターニングが実験室環境で実行されました。 まず、ＰＤＭＳプレポリマーとその架橋剤（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ａｕｂｕｒｎ、ＭＩ）を１０：１の比率で混合し、シリコンマスターモールド上に注いだ。 デシケーターで1時間脱気した後、PDMSを65℃のオーブンで4時間硬化させ、シリコンマスターモールドから切り取って剥がしました（補足図3a、i）。 PDMS 層の表面は酸素プラズマを使用して活性化され、トリクロロ (オクチル) シランで 8 時間コーティングされました。 以前に作製されシランでコーティングされたPDMS層は、デバイスのネガパターンを有する二次PDMSモールドの作製のためのモールドとして使用されました（補足図3a、ii）。 剥離後（補足図3a、iii）、二次PDMSモールドを使用して、デバイス材料として使用される光硬化性パーフルオロポリエーテル（PFPE）ベースのポリマー（Fluorolink MD700、Solvay）をパターン化しました。 PDMS から PDMS への成形プロセスに続いて、二次 PDMS モールド (補足図 3b、i) をポリエチレン テレフタレート (PET) シート上に配置し、4% w/w 2-ヒドロキシ-2-と混合した Fluorolink MD700 を充填しました。 50 mbar 真空下でメチルプロピオフェノン (Darocur 1173)。 型が充填されると、ポリマーがUV光で硬化され（図3a、iv）、二次PDMS型がPETシート/デバイススタックから剥がされ（補足図3a、v）、デバイスが（補足図3a） .3b、ii-iv）は、4°Cの熱電冷却器上で下にあるPETシートから放出され、損傷することなくポリマーデバイスの容易な放出が促進されます（補足図3a、vi）。

クラスターウェルの特性評価のために、有効濾過面積が小さい分析バージョンのデバイスを利用しました。 カメラの記録フレームレート制限により 1 ～ 1.5 mL/h の流量範囲を使用する一方で、マイクロメッシュでの流速はデバイスのサイズを変えることによって調整され、サイズの減少は流量の増加に対応しました。 これらの特性評価研究では、10 mL の全血を処理する際に、各マイクロウェルで処理される血球数が実際のデバイス (直径 47 mm) の数と同等になるように、血液サンプルの量も実用的な制限内で調整されました。テストされた各条件ごとに。 したがって、約 750、約 375、および約 200 μL の全血を使用して、それぞれ 25、100、および >250 mL/h の流量でのデバイスの性能をテストしました。 より小さい直径のデバイスを、中空 PDMS 層に一致するサイズの市販の直径 13 mm フィルター ホルダー (GE Healthcare Life Sciences) に取り付けました。これにより、特定の直径の対象領域への流体の流れが制限され、内部の停滞した流れ領域の形成が防止されます。フィルターホルダー。 サンプルを導入する前に、実験装置 (図 2b) を純粋なエタノールでプライミングし、その後 PBS で洗浄しました。 次に、非特異的な細胞接着を最小限に抑えるために、セットアップを 3% ウシ血清アルブミン (BSA) とともに 1 時間インキュベートしました。 Hoechst 色素で染色した細胞 (細胞培養と調製に関する別のセクションを参照) を全血に添加し、シリンジ ポンプ (Harvard Apparatus Infuse/Withdraw PHD Ultra) を使用して回収モードで実験セットアップを実行しました。 スパイクされた細胞クラスターを含む血液は、2 チャネルマイクロ流体インターフェースの入力チャネル (高さ 50 μm、幅 500 μm)、デバイス/フィルターホルダーアセンブリ、そして最後に出力チャネル (高さ 50 μm、幅 500 μm) を通過しました。マイクロ流体界面の様子。 クラスターの分析バージョンに出入りする細胞を追跡するために、倒立蛍光顕微鏡 (Eclipse Ti、Nikon、メルビル、ニューヨーク州) を使用して、入力および出力のマイクロ流体チャネルを蛍光 (DAPI) チャネルで 50 フレーム/秒で同時にビデオ記録しました。それぞれ井戸。 次に、録画されたビデオをカスタム構築ソフトウェア (Visual Studio、2017) で処理し、各クラスター内のセルの数に関してデバイスに出入りするクラスターの数を取得し、これを計算に使用しました。捕獲効率。

イメージング システムの信頼性をテストするために、デバイスを取り付けずに 2 チャネルのマ​​イクロ流体インターフェイスをループで操作しました。この場合、入力チャネルの出口は、長さ 8 cm の内径 0.02 インチのチューブを使用して出力チャネルの入口に接続されました。実験は、1.5 mL/h に設定されたシリンジ ポンプを使用して実行され、両方のマイクロ流体チャネルは、蛍光 (DAPI) チャネルを使用して 50 フレーム/秒でビデオ記録されました。カスタム作成ソフトウェアを使用して、いずれかのマイクロ流体チャネルで細胞イベントを含むフレームを抽出しました。フレームを分析した後、入力チャネルと出力チャネルを通過するクラスターのサイズ分布を比較したときに、システムに事実上損失がないことが観察されました (補足表 1)。では、デバイス上で分離されたクラスターを直接計数することにより、25 mL/h で捕捉効率実験を実行しました。これらの実験では、正確なスパイク クラスター数を得るために、前述のようにマイクロ流体チャネルを使用してスパイク集団を画像化しました。 クラスターは、10 mL の全血が入った EDTA チューブに注入され、その後、クラスターウェルを使用して、スパイクされた血液サンプルが 25 mL/h で処理されました。 蛍光顕微鏡を使用してデバイスを画像化し、捕捉効率を測定するために捕捉されたクラスター数をスパイク集団と比較しました（補足図4）。これは、マイクロ流体インターフェースを使用して得られた捕捉効率データと一致しました。

モデル生体サンプルとして、HeyA8 (ジョージア工科大学のジョン F. マクドナルド博士から入手)、LNCaP (ATCC-CRL-1740; マナサス、バージニア州)、MDA-MB-231 (ATCC-HTB-26; マナサス) を使用しました。 、バージニア州）およびMCF-7（ATCC-HTB-22;バージニア州マナッサス）細胞株。 細胞株は、10% ウシ胎児血清 (FBS) (Seradigm、ペンシルベニア州ラドナー) を含む RPMI-1640 (LNCaP および HeyA8) または DMEM (MDA-MB-231 および MCF-7) 培地で、5% CO2 雰囲気下で培養しました。 37℃。 ８０％コンフルエンスに達したら、０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を２分間使用して細胞を培養フラスコから剥がした。 続いて、細胞をペレット化し、上清を除去し、穏やかにピペッティングすることによって細胞を1×PBS溶液に再懸濁した。 この研究で使用されたすべての細胞株について、ペレット化された細胞は最初、数百から数千の細胞のグループで互いに接着していることがわかり、その後、ピペッティングによって機械的に、研究で対象となるサイズ範囲内のより小さなクラスターに解離されました。

捕捉効率実験では、クラスターを視覚的に追跡するために核染色を実行しました。 フラスコ表面から細胞を剥離する前に、細胞を 4 mL Hoechst 33342 (Thermo Fisher – Cat No: H3570) 色素溶液 (1:1000) 中で 20 分間、5% CO2 雰囲気中、37°でインキュベートすることにより細胞核を標識しました。 C. 染色溶液を洗い流した後、細胞を剥がし、1×PBS溶液に再懸濁した。 懸濁液の少量のアリコート (<10 μL) を使用して、実験ごとに数百 (184 ～ 552 クラスター) の細胞クラスターを含む試験サンプルを調製しました。 実験におけるスパイク クラスターの数は、(1) スパイク クラスターの母集団が、包括的なテストのためにさまざまなサイズのクラスターを含めるのに十分な大きさであること、および (2) クラスターの数が大部分のクラスタでデバイスを飽和させないことを保証するように設定されました。井戸は空のままです。

細胞の生存率を決定するために、生死アッセイ (ab115347、Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州) を製造業者の指示に従って実行しました。 アッセイを、コントロールおよび放出された細胞を含む１×ＰＢＳ溶液と５×濃度（１：２００）で混合した。 暗所で 15 分間インキュベートした後、倒立蛍光顕微鏡 (Eclipse Ti、Nikon、メルビル、ニューヨーク州) でサンプルを画像化しました。生細胞と死細胞が緑色 (FITC) と赤色 (TexasRed) のチャンネルで観察されました。それぞれ（補足図9）。

捕捉されたクラスターは、最初に 2.5% グルタルアルデヒドで固定され、次に 1% 四酸化オスミウムで固定され、両方とも 0.1 M カコジル酸ナトリウムで希釈されました。 固定後、細胞を 50%、70%、80、95% エタノール水溶液および 100% エタノール中でそれぞれ 15 分間連続して脱水しました。 サンプルをヘキサメチルジシラザン（HMDS）（ペンシルベニア州ハットフィールドの電子顕微鏡科学社）で洗浄し、室温で一晩乾燥させた。 デバイスと捕捉されたクラスターは、スパッタリング システムを使用して Pt/Pd でコーティングされ、Hitachi SU8230 走査型電子顕微鏡を使用して画像化されました。

同意した健康なドナーからの血液サンプルは、ジョージア工科大学で IRB 承認のプロトコルに従って収集されました。 前立腺がん患者の血液サンプルはエモリー大学病院とグレイディ記念病院で採取され、卵巣がん患者の血液および腹水サンプルはノースサイド病院で IRB 承認のプロトコールに基づいて採取されました。 血液サンプルは EDTA チューブ (BD Vacutainer) に収集され、採血後 4 時間以内に処理されました。 沈降を防ぐために、使用するまでチューブをロッカー上に置きました。 卵巣がん患者からの腹水サンプルは、真空のガラス容器に入れてジョージア工科大学に移送され、採取後 4 時間以内に処理されました。

デバイスをフィルター ホルダー内に置き、純粋なエタノールで湿らせました。 湿潤後、エタノールを1×PBSで洗い流した。 使用前に、デバイス/フィルターホルダーアセンブリを 3% BSA で 1 時間インキュベートして、表面への非特異的細胞接着を最小限に抑えました。 次いで、血液または腹水サンプルを導入する前に、BSAを1×PBSで洗い流した。 腹水サンプルと未処理の全血サンプルの両方を、シリンジポンプ (Harvard Apparatus Infuse/Withdraw PHD Ultra) を使用し、流速 25 mL/h の吸引モードで装置に流しました。 次に、免疫蛍光染色の前に、1× PBS 溶液を使用してデバイスを 1 時間洗浄しました (CTC クラスターの免疫蛍光染色に関する別のセクションを参照)。

サンプルを処理した後、捕捉された細胞を 4% パラホルムアルデヒド (Electron Microscopy Sciences、ペンシルバニア州ハットフィールド) で 10 分間固定し、その後 PBS 中の 1% Triton-X (Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス) で透過処理しました。 10分。 免疫蛍光染色の前に、デバイス/フィルターホルダーアセンブリを 2% ヤギ血清および 3% BSA を含むブロッキングバッファーで 30 分間インキュベートしました。 前立腺サンプルの場合、サイトケラチン 8/18 (Invitrogen - カタログ番号: MA5-32118、クローン: SU0338、(1:400))、ビメンチン (Invitrogen - カタログ番号: MA5-14564、クローン: SP20、(1:1000)) 、PSA/KLK3 (Cell Signaling Technology - カタログ番号: 5365S、クローン: D6B1、(1:750))、EpCAM (Invitrogen - カタログ番号: MA5-29246、クローン: 28、(1:400))、および抗 CD45 (BD Biosciences - カタログ番号: 555480、クローン: HI30、(1:500))、卵巣サンプルの場合はサイトケラチン 7 (Invitrogen - カタログ番号: MA5-32173、クローン: ST50-05、(1:400))、サイトケラチン 8/18 (Invitrogen - カタログ番号: MA5-32118、クローン: SU0338、(1:400))、ビメンチン (Invitrogen - カタログ番号: MA5-14564、クローン: SP20、(1:1000)) および抗 CD45 (BD Biosciences - カタログ番号: 555480、クローン: HI30、(1:500)) 一次抗体カクテルを導入し、一晩インキュベートしました。 過剰な抗体を1×PBSで洗い流した。 次に、対応する二次抗体 Alexa Fluor 488 (Invitrogen - カタログ番号: A-11008、(1:500)) および Alexa Fluor 594 (Invitrogen - カタログ番号: A21125、(1:500)) をデバイスに流し、インキュベートしました。 １時間放置し、１×ＰＢＳで洗い流した。 細胞の核を4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(Invitrogen - カタログ番号: D1306、(1:1000))で10分間染色し、デバイスを1×PBSで洗浄した。 最後に、デバイスをフィルター ホルダーから取り外し、イメージングのために 2 枚のスライド ガラスの間に取り付けました。

捕捉された生きた CTC クラスターは、EpCAM (Cell Signaling Technology – カタログ番号: 5198S、(1:400))、前立腺特異的膜抗原 (PSMA) (Biolegend – カタログ番号: 342506、クローン) に対する Alexa 488 結合抗体で染色されました。 :LNI-17、(1:80))、汚染された WBC を PE-CD45 (TRITC) (BioL​​egend – カタログ番号: 368510、クローン: 2D1、(1:40)) で染色しました。 捕捉されたクラスターを含むデバイスをペトリ皿に取り付け、倒立蛍光顕微鏡 (Eclipse Ti、Nikon、メルビル、ニューヨーク州) を使用して画像化しました。 同定されたクラスターはデバイスから直接顕微操作され、Eppendorf TransferMan 4r 顕微マニピュレーターを使用して RLT (Qiagen) + BME (Sigma-Aldrich) バッファーを含む PCR チューブに移されました。 マイクロマニピュレーション中、マイクロウェルの乾燥を防ぐためにディッシュに 1× PBS を補充しました。乾燥には室温で約 10 分かかることが観察されました。チューブを 1 分間ボルテックスし、-80 °C の冷凍庫に移しました。 汚染された白血球のほとんどは、クラスターの回収中にデバイスに付着したままであることが観察されました。 それにもかかわらず、クラスターウェルから顕微操作されたCTCクラスターは空のペトリ皿に排出され、RNA配列決定におけるWBC汚染による潜在的なアーティファクトを確実に防ぐために再採取されました。

血液サンプルは、Cluster-Wells を使用して 25 mL/h の流速で処理されました。 捕捉された細胞の核は Hoechst 色素 (Thermo Fisher – カタログ番号: H3570、(1:1000)) で染色され、汚染された WBC の膜は PE-CD45 (TRITC) (BioL​​egend – カタログ番号: 368510) で染色されました。 、(1:40)) デバイス上の潜在的な CTC クラスターを否定的に特定します。 濃縮された CTC クラスターが最初にベースラインとしてデバイス上で画像化され (補足図 11、i)、続いてデバイス上の CTC クラスターが膜完全性ベースの生存率アッセイ、NucRed Dead 647 Ready Probes (Thermo Fisher – カタログ番号: R37113) に供されました。 )、メーカーが提供するプロトコルごとに。 アッセイされたCTCクラスターの蛍光画像を撮影して、生存率レポーター色素蛍光（Cy-5）を記録しました（補足図11、ii）。 腫瘍の起源を証明するために、細胞を 4% PFA で固定し、デバイスをフィルターホルダー内に置き、サイトケラチン 7、8/18、ビメンチン (FITC)、および CD45 (テキサスレッド) に対する抗体を使用して固定染色プロトコルを適用しました。そしてクラスターは蛍光顕微鏡で画像化されました（補足図11、iii）。 次に、固定された CTC クラスターをネガティブコントロールとしてアッセイすることで生存率アッセイを検証し、CTC クラスターを蛍光顕微鏡でもう一度画像化して、固定細胞の膜の損傷による陰性の生存率の結果を確認しました（補足図 11、iv）。 。

Macherey-Nagel Nucleospin RNA XS キットを使用して、溶解サンプルから RNA を抽出しました。 二本鎖 cDNA は、Takara Bio SMART-Seq v4 超低入力 RNA キットを使用してシーケンス用に生成されました。 次に、Illumina Nextera XT DNA ライブラリー調製キットを使用してタグメンテーション時間を 3 分に短縮して、バーコード付き Illumina 互換シーケンシング ライブラリーを生成し、サンプルを 1:1 のビーズ比を使用して洗浄してプライマー ダイマーの存在を除去しました。 ライブラリーの品質は、DNA 高感度チップを使用する Agilent Bioanalyzer で決定され、濃度は Invitrogen Qubit 蛍光光度計を使用して決定されました。 次に、バーコード化されたサンプルがプールされ、Illumina NextSeq 500 および NovaSeq 6000 で配列決定されました。

生の fastq ファイルは、FASTQC を使用して品質が分析され、TrimGalore (参照: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore) を使用してトリミングされ、アダプター シーケンスと低品質リード (最小 Phred スコア > 24) が削除されました。 トリミングされたリードは、STAR マッパー (PMID: 23104886) を使用してヒトゲノムの hg38 ビルドにマッピングされ、ヒト トランスクリプトームの GenCODE.v24 アノテーション バージョンにマッピングすることで転写物が定量化されました。 これらの前立腺 CTC クラスターでは、中央値 83.15 M リードが STAR マッパー (範囲 53.7 ～ 129.79 M) に入力され、中央値 88.8% リードがヒト トランスクリプトーム (範囲 80.57 ～ 91.59%) に独自にマッピングされました。 1 つのサンプルで少なくとも 10 のマップされたリードで合計 16,412 の転写物が検出され、R (PMID: 25516281) での DESeq2 解析に使用されました。 DESeq2 log2foldchange によってランク付けされた合計 12,149 個のマップされた Ensembl 遺伝子が、WebGestalt ツール (PMID: 28472511) を使用した GSEA 分析 (PMID: 17644558) の入力として使用されました。 強化された遺伝子セットは、Cancer Hallmark 50 遺伝子セットと KEGG Pathway 遺伝子セットを使用して分析されました。 t-SNE 分析は、シード = 123、パープレキシティ = 1 の M3C パッケージを使用して R で実行されました。総リード数は、Cufflinks (PMID: 22383036) を使用して FPKM 値に正規化されました。 少なくとも 1 つのサンプルで合計 26,391 個の転写産物の FPKM > 1 があり、10,885 個の転写産物の FPKM > 中央値は 1 でした。ヒートマップ プロットで使用するために、遺伝子の 100 万あたりの読み取り数 (RPM) カウントが生成されました。 最後に、ClustVis オンライン ツールを使用してヒートマップ プロットを生成しました。

特性評価実験は 3 つの独立した実験として実行されました。 特に明記しない限り、データは平均値 ± SD として表示されます。 サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。 実験はランダム化されていませんでした。 製造されたデバイスは、特性評価実験と患者サンプル処理のためにランダムに選択されました。 患者サンプルは、腫瘍の起源 (前立腺と卵巣) に基づいて異なるグループに割り当てられました。 患者の血液サンプルの処理には盲検法が使用され、がんの種類以外のすべての患者情報は研究が終了するまで保留されました。 RNA 配列データは、著者らによる評価の前に、公平なバイオインフォマティクス パイプラインによって処理されました。 代表的な実験を図１〜３に示す。 図１ｂ、２ａ、３ｅおよび補足図。 3b、9、10 は説明のために 1 回実行されました。 同様に、図２、３、４、５、６、７、８、９、９ 4a〜c、5a、b、および補足図。 図１０、１１ａ、ｂは特定の患者サンプルに対応し、実験はこれらのサンプルの処理時に一度実行された。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

著者らは、この研究の結果を裏付けるデータが論文およびその補足情報ファイル内で入手可能であることを宣言します。 この研究で生成された生の配列決定データと処理された配列決定データは、アクセッション コード GSE202650 で NCBI の遺伝子発現オムニバス データベース (GEO) に保管されています。 この研究で使用された公開されているデータセットは、Hallmark50 遺伝子セット [https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/genesets.jsp?collection=H]、ヒトゲノムの hg38 ビルド [https://www. ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.40]、KEGGパスウェイデータベース[https://www.genome.jp/kegg/pathway.html]、「CHANDRAN_METASTASIS_TOP50_UP」遺伝子セット[https://www.gsea- msigdb.org/gsea/msigdb/cards/CHANDRAN_METASTASIS_TOP50_UP]、「TOMLINS_PROSTATE_CANCER_UP」遺伝子セット [https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/TOMLINS_PROSTATE_CANCER_UP]。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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著者らは、この研究に参加したすべての患者と健康な献血者に感謝したいと思います。 著者らはまた、Georgia Tech Molecular Evolution CoreのAnton V. Bryksin博士とNaima Djeddar博士、Emory Integrated Genomics Core (EIGC)のSakeenah Hicks博士、Christopher Scharer博士とLyra M. Griffiths博士、およびHenry R. Johnston博士に感謝します。 Emory Integrated Computational Core (EICC) の Robert A. Arthur 博士は、RNA シーケンスとデータ解析における貢献に対して感謝します。 健康なドナーからの採血を手伝ってくれたジョージア工科大学スタンプス・ヘルス・センターのスタッフ。 この研究は、ジョージア工科大学から AFS に提供されたスタートアップ資金によって支援されました。 この研究は、賞番号 W81XWH-20-1-0649 (AFS)、ジョージア工科大学プチ研究所シード助成金 (AFS および JFM) に基づく前立腺がん研究プログラムを通じて、国防次官補健康問題局からも一部支援を受けました。 ）、ダンウッディ ゴルフ クラブ前立腺がん研究賞、およびエモリー大学 Winship Cancer Institute（AFS および MAB）からの Winship Invest$ Pilot Grant を受賞しています。

米国ジョージア州アトランタ、ジョージア工科大学電気コンピュータ工学部

メルト・ボヤ、テブヒデ・オズカヤ=アフマドフ、ブランディ・E・スウェイン、チア・ヘン・チュー、ノル・アスマレ、オズグン・シヴェレコグル、ルーシュウ・リウ、ドーワン・リー、A.ファティ・サリオグル

婦人科腫瘍大学、米国ジョージア州アトランタ

シェリー・トビア

Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience、ジョージア工科大学、米国ジョージア州アトランタ

シュエタ ビリヤ、L. デエット マクドナルド、ジョン F. マクドナルド、A. ファティ サリオグル

ジョージア工科大学生物科学部、米国ジョージア州アトランタ

L. デエット マクドナルド & ジョン F. マクドナルド

Winship Cancer Institute、エモリー大学、アトランタ、ジョージア州、米国

バッセル・ナザ、オメル・クチュク、カルロス・S・モレノ、メフメット・A・ビレン、A・ファティ・サリオグル

米国ジョージア州アトランタ、エモリー大学医学部血液内科・腫瘍内科

バッセル・ナザ、オメル・クチュク、メフメット・A・ビレン

米国ジョージア州アトランタ、エモリー大学医学部泌尿器科

マーティン・G・サンダ

米国ジョージア州アトランタ、ジョージア工科大学統合がん研究センター

ベネディクト・B・ベニーニョ、ジョン・F・マクドナルド、A・ファティ・サリオグル

卵巣がん研究所、米国ジョージア州アトランタ

ベネディクト・B・ベニーノ＆ジョン・F・マクドナルド

米国ジョージア州アトランタ、エモリー大学医学部病理学および臨床検査医学部門

カルロス・S・モレノ

ジョージア工科大学エレクトロニクス・ナノテクノロジー研究所、米国ジョージア州アトランタ

A. ファティ・サリオグル

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MB と AFS は研究を計画し、原稿を執筆しました。 MB と RL はデバイスを製造しました。 MBは実験を行った。 MB と NA は分析ソフトウェアを開発しました。 MB と AFS はデータを分析しました。 ST、LDM、BN、OK、MGS、BBB、MAB、JFM が患者サンプルの収集を支援しました。 MB、TOA、BES、および CHC は患者サンプルを処理および分析しました。 SB はライブラリーの調製と RNA シーケンスを支援しました。 CSM は配列データを処理および分析しました。 TOA、NA、OC、DL が原稿の作成に協力してくれました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

A. ファティ・サリオグルへの通信。

MB と AFS は、ジョージア工科大学が出願した特許 (米国特許出願番号 17/619,276) の発明者です。 この特許出願は、開発された CTC クラスター分離技術を対象としています。 残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Sunitha Nagrath と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Boya、M.、Ozkaya-Ahmadov、T.、Swain、BE 他。 メッシュマイクロウェル内の循環腫瘍細胞クラスターのハイスループット、ラベルフリー単離。 Nat Commun 13、3385 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-31009-9

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受信日: 2020 年 11 月 23 日

受理日: 2022 年 5 月 26 日

公開日: 2022 年 6 月 13 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31009-9

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